Sansanmycin生物合成基因ssaX的表達(dá)、純化及功能鑒定.pdf

1、Sansanmycin(SS)是一組尿苷肽類抗生素，由我國貴州土壤中發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌Streptomyces sp.SS所產(chǎn)生。Sansanmyc in對銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis及多重耐藥結(jié)核分枝桿菌具有很好的抑制作用。此類抗生素家族還包括pac ida mycin，nap sa myc in和mure ido myc in等。這類化合物結(jié)構(gòu)中

2、含有一種非蛋白質(zhì)氨基酸，即間位酪氨酸(m-Tyr)，在自然界中極少存在。pac idamycin,napsamyc in，sansanmycin的生物合成基因簇均已被克隆，對pacX基因功能研究顯示其為一種新的苯丙氨酸羥化酶，負(fù)責(zé)催化苯丙氨酸(Phe)羥化形成肽鏈骨架中的m-Tyr。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)sansanmyc in基因簇中的ssaX基因與pacX基因和npsK基因有高度的同源性，有可能負(fù)責(zé)sansanmycin肽鏈骨架中

3、m-Tyr的合成。
　　本研究以Streptomyces sp.SS基因組為DNA模板擴增ssaX基因，利用帶His標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒pET16b成功構(gòu)建了重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET16b-ssaX，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，獲得了表達(dá)His10-SsaX蛋白的重組菌株。初步優(yōu)化了His10-SsaX蛋白可溶性表達(dá)的發(fā)酵條件，即重組菌株在LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6，以0.02mM IPTG于16℃誘導(dǎo)24 h。

4、初步優(yōu)化了菌體蛋白中His10-SsaX親和層析純化條件，采用含200 mM咪唑的蛋白洗脫液將結(jié)合在柱子上的目的蛋白His10-SsaX進(jìn)行洗脫。最終每升LB發(fā)酵液獲得SsaX蛋白粗品9.9 mg，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，蛋白粗品純度達(dá)到61.7％。建立了體外酶促反應(yīng)體系，采用HPLC熒光檢測終產(chǎn)物的生成，確證重組蛋白SsaX能夠催化Phe生成m-Tyr，反應(yīng)中也有少量對位酪氨酸(p-Tyr)生成，SsaX蛋白的催化產(chǎn)物p-Tyr