家蠶BH4合成代謝途徑的基因鑒定與表達調控功能研究.pdf

1、四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin, BH4）是芳香族氨基酸羥化酶的必需輔酶，同時，也是一氧化氮合酶和烷基甘油單加氧酶必需的輔因子，其合成不足或代謝缺陷會導致哺乳動物罹患多種神經性疾病。目前研究得比較清楚的是 BH4的生物合成分為三條途徑，即以 GTP為初始底物，經過三個酶的催化最終生成BH4的從頭合成途徑，以中間產物墨蝶呤為底物，經過兩步反應生成BH4的補救合成途徑，以及BH4參與催化反應后，經過兩個酶的催化重新生成

2、BH4的重生途徑。但是BH4生物合成的調控網絡中尚存不明之處：當從頭合成途徑受阻或部分受阻發(fā)生時，選擇性合成支路及其調控因子的作用機制有待探明；不同合成途徑在生物體內的時空作用模式及功能地位尚不清楚。家蠶（Bombyx mori）作為鱗翅目的模式昆蟲，遺傳背景清晰，目前基因組框架圖和精細圖均已完成，數據庫信息完善。國內外保存有數百種家蠶突變體種質資源，包括很多研究人類疾病相關問題的寶貴生物資源。家蠶黃體色lemon（lem）、黃體色致死

3、lemon lethal（leml）以及白化致死體albino（al）等突變體是不同程度的BH4合成缺陷型，是研究 BH4合成代謝途徑及其調控機理的理想模型。本研究利用家蠶野生型品系大造（p50），BH4合成相關突變品系以及家蠶 BmN細胞系為材料，對家蠶BH4合成代謝途徑的基因進行網絡克隆鑒定，表達互作模式及其調控BH4合成功能等方面的研究，主要獲得以下結果：
　　1.從家蠶野生型品系p50五齡三天的幼蟲中克隆得到了BH4重生途

4、徑中的蝶呤-4α-甲醇胺脫水酶基因（BmPcd）和二氫喋啶還原酶基因（BmDhpr），通過序列比對發(fā)現，這兩個基因與其他物種相應基因的同源性較高，與果蠅的同源性最高。對兩個基因在不同突變品系中的時空表達模式進行了分析，發(fā)現兩個基因的時空表達模式存在較大差異。通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化得到了BmPCD和 BmDHPR蛋白，對重組 BmDHPR蛋白進行了酶學特性鑒定，重組BmDHPR蛋白在室溫和pH為7的條件下活性最高，對輔酶NADH的

5、親和性大于NADPH，對底物DMPH2親和性較差顯示出較高的底物專一性?；趐50和lem突變體品系 ah09的體內比較酶活實驗結果表明，當從頭合成途徑受阻導致BH4合成不足時，B. mori主要激活腦和性腺等組織的重生途徑。
　　2.針對 BH4從頭合成途徑中的墨蝶呤還原酶基因 BmSpr，補救合成途徑中的二氫葉酸還原酶基因BmDhfr和重生途徑中的BmDhpr等基因分別設計了2-4條合適的shRNA，并構建了相應的RNA干涉載

6、體。分析了不同轉染試劑對干涉載體轉染BmN細胞轉染效率的影響，并利用熒光定量RT-PCR的方法篩選出了干涉效果較好的shRNA干涉載體。在BmN細胞中，發(fā)現干涉BmDhfr的表達對其他BH4合成相關基因的表達無明顯影響，但干涉BmSpr的表達使BmPtps和BmDhfr的表達明顯上調。以上結果說明BH4的從頭合成途徑受到抑制時，補救合成途徑可能會發(fā)揮積極作用；相較SPR來說，GTPCH和PTPS是BH4從頭合成途徑的更為重要的限速酶。另

7、外，通過蠶卵顯微注射的方式進行了shRNA介導的轉基因干涉BmSpr表達的初步實驗。
　　3.以哺乳動物參與BH4合成相關的醛酮還原酶（AR）和羰基還原酶（CR）的氨基酸序列為查詢對象，在中日家蠶基因組數據庫和全長 cDNA文庫進行同源基因BLAST檢索，共得到了14個家蠶醛酮還原酶基因（BmAr）的17個轉錄本，以及8個家蠶羰基還原酶基因（BmCr）的9個轉錄本，分別構建了不同物種間AR的進化樹和CR的進化樹，發(fā)現BmAR12和

8、BmAR13與已報道的BH4合成相關的AR親緣關系最近。半定量RT-PCR分析了所有BmAr, BmCr預測基因在p50和ah09品系中的表達差異模式，推定BmAR2和BmCR3可能參與家蠶BH4的合成代謝途徑。
　　綜上所述，補救途徑和回收途徑在家蠶 BH4合成代謝系統(tǒng)中可能具有較為重要的生物學功能，本研究所取得的進展為今后全面闡釋家蠶 BH4合成代謝網絡的分子調控機制奠定了必要的生物化學與分子生物學實驗基礎，為開展將家蠶BH4