龍眼在酸雨脅迫下基因的差異表達(dá)及DHAR基因的克隆.pdf

1、酸雨的污染是當(dāng)代國(guó)際性的重大生態(tài)環(huán)境問(wèn)題，以烏龍嶺龍眼成年樹(shù)為材料，研究pH 2.5、3.5、5.6(對(duì)照)的模擬酸雨脅迫下龍眼葉片基因的差異表達(dá)。對(duì)龍眼葉片RNA的提取方法作出探索，以此為模板對(duì)影響DDRT-PCR擴(kuò)增的重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，并建立了適合龍眼葉片的差異顯示分析體系，最佳體系為：25 μl體系中RNA投入量為3.0 μg，錨定引物濃度0.8 μmol/L，隨機(jī)引物濃度0.8 μmol/L，dNTP濃度200 μmol/L

2、，Taq酶濃度1.25 U，退火溫度40℃。找出一個(gè)與酸雨脅迫有關(guān)的EST序列，登錄到GenBank上，其登錄號(hào)為FC860625,BLASTN核苷酸同源性比較結(jié)果顯示此片段與己報(bào)道的楊樹(shù)葉片受干旱脅迫的EST有75％的同源性。另外，利用BLASTX蛋白質(zhì)同源性查詢，其可能的編碼產(chǎn)物與葡萄上的一個(gè)未命名的蛋白產(chǎn)物存在66％左右的相似性，與水稻上一個(gè)假定的轉(zhuǎn)錄起始因子存在59％的相似性，與擬南芥ATP結(jié)合因子/RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子存在3

3、9％的相似性。推測(cè)此差異片段可能是龍眼對(duì)酸雨信號(hào)感知后產(chǎn)生的第二信使物質(zhì)激活的轉(zhuǎn)錄因子，引起酸雨相應(yīng)基因的表達(dá)；也可能與脅迫條件下進(jìn)行無(wú)氧呼吸、能量的加快消耗有關(guān)。 根據(jù)蘋果、番茄、擬南芥、小麥上已克隆得到的DHAR同源基因的保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)合成兼并引物，在龍眼葉片上克隆得到了長(zhǎng)度為437bp龍眼中的DHAR保守區(qū)片段；利用RACE方法，根據(jù)本試驗(yàn)所得的DHAR cDNA保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)3'端特異引物，克隆得到了此基因3'端的序