水稻中ANR1同源基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、水稻是我國(guó)乃至全世界的主要糧食之一。而在稻田系統(tǒng)中，氮素又是水稻生產(chǎn)中重要的一個(gè)限制性大量元素，同時(shí)也是提高其產(chǎn)量的重要因素之一。在水稻的生長(zhǎng)過(guò)程中有兩種形態(tài)的氮提供其營(yíng)養(yǎng)需求，其中銨態(tài)氮是主要的N源，能滿足其正常的生長(zhǎng)生理需求。有許多研究結(jié)果也表明水稻根系具有一定的泌氧能力使得根際硝化作用產(chǎn)生一定的硝態(tài)氮，最后以NO3-的形式被水稻根系吸收，因此硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)對(duì)水稻生長(zhǎng)也非常重要。
　　 NO3-既能提供給植物營(yíng)養(yǎng)，又作為一種信號(hào)

2、分子調(diào)控著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。擬南芥中的ANR1基因，其主要是受硝態(tài)氮饑餓的誘導(dǎo)，調(diào)控?cái)M南芥?zhèn)雀纳L(zhǎng)。通過(guò)blastp搜索到了ANR1在水稻中5個(gè)同源基因:OsMADs23，OsMADs25，OsMADs27，OsMADs57和OsMADs61。在本論文中，以這5個(gè)基因作為研究的目標(biāo)基因。通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)各個(gè)基因在水稻不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5個(gè)基因在根中都具有較高的表達(dá)水平，其中OsMADs23，OsMADs25，OsMAD

3、s61主要是在根中表達(dá)。因此以提取水稻根的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，進(jìn)行基因克隆，構(gòu)建了OsMADs25，OsMADs27，OsMADs57，OsMADs61的過(guò)量表達(dá)載體和RiOsMADs27，RiOsMADs57干擾載體。并同時(shí)轉(zhuǎn)化水稻及擬南芥，在水稻中得到了OsMADs27的轉(zhuǎn)基因植株，擬南芥里也得到了OsMADs25，OsMADs27，OsMADs57的轉(zhuǎn)基因植株并收獲T0代種子。
　　 同時(shí)為了研究目標(biāo)基因?qū)、

4、P、S不同營(yíng)養(yǎng)的響應(yīng)，我們以粳稻“日本晴(Nipponbare)”為材料，采用水培的方法，得到了以下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.當(dāng)以1.25 mM琥珀酸銨作為水稻生長(zhǎng)的唯（一）N源時(shí)，將14 d苗齡的植株轉(zhuǎn)移到1.25 mM的NH4NO3的營(yíng)養(yǎng)液里生長(zhǎng)，進(jìn)行硝態(tài)氮短時(shí)間誘導(dǎo)，分別在0、0.5、1、2、4h取樣，利用qPCR檢測(cè)了目標(biāo)基因以及標(biāo)記基因OsNAR2.1（硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsNAR2.1在0.5 h

5、時(shí)表達(dá)水平提高，隨后表達(dá)水平逐漸下降，在4h時(shí)降為0h的水平;OsMADs57在0.5 h時(shí)，表達(dá)水平提高，隨后表達(dá)水平逐漸下降，而OsMADs23，OsMADs25，OsMADs27，OsMADs61的表達(dá)水平均逐漸下降，說(shuō)明在以NH4+為唯一氮源生長(zhǎng)時(shí)，OsMADs57和OsNAR2.1是受NO3-短時(shí)間的誘導(dǎo)。
　　 2.當(dāng)以1.25 mM KNO3為唯一氮源供水稻生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)14d苗齡的植株進(jìn)行缺氮3d，然后分別以1.25

6、 mM KNO3，1.25 mM NH4Cl，1.25 mM Gln誘導(dǎo)處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺N3d時(shí)，OsMADs23，OsMADs25，OsMADs27和OsMADs61的表達(dá)水平提高，而OsMADs57表達(dá)水平變化不明顯。再供氮時(shí)，無(wú)論是任何形態(tài)的N，OsMADs25和OsMADs61的表達(dá)水平都受到抑制。說(shuō)明OsMADs25和OsMADs61受N饑餓的誘導(dǎo)。
　　 3.以水稻營(yíng)養(yǎng)液生長(zhǎng)的植株，對(duì)14d苗齡的植株分別進(jìn)行缺P(pán)或

7、S處理7d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺P(pán)7 d時(shí)，OsMADs23，OsMADs25，OsMADs27，OsMADs57，OsMADs61的表達(dá)水平下降，說(shuō)明這些基因的表達(dá)受缺P(pán)的抑制。缺S7d時(shí)，OsMADs23，OsMADs27，OsMADs57和OsMADs61的表達(dá)水平下降，OsMADs25的表達(dá)水平提高，說(shuō)明OsMADs25受S饑餓誘導(dǎo)，OsMADs23，OsMADs27，OsMADs57和OsMADs61的表達(dá)受缺S的抑制。