桑樹(shù)RALF基因及表達(dá)模式分析.pdf

1、植物在自然界中處于非常復(fù)雜的生活環(huán)境，面臨生物脅迫(昆蟲(chóng)、真菌、細(xì)菌和病毒)和非生物脅迫。植物肽激素是重要的胞間信號(hào)感應(yīng)分子,調(diào)節(jié)植物的防御和發(fā)育過(guò)程?？焖賶A化因子（rapid alkalinization factor,RALF）是一種在植物中廣泛存在的植物肽激素,能夠引起胞外pH的迅速升高,并參與植物的發(fā)育調(diào)控。而植物胞外pH變化是植物調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的重要反應(yīng)，并參與包括離子吸收、溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁生長(zhǎng)等生理過(guò)程。

2、而且胞外H+濃度的瞬時(shí)變化及其所伴隨的細(xì)胞質(zhì)膜的極化和去極化都與細(xì)胞對(duì)環(huán)境刺激的快速反應(yīng)有關(guān)，這些環(huán)境刺激包括膨壓和重力的變化、病原菌的侵染以及非生物脅迫等。
　　桑樹(shù)是一種多年生木本植物，除了其桑葉能為家蠶提供食物外，桑樹(shù)還具有重要的食用價(jià)值、藥用以及生態(tài)保護(hù)功能。例如，現(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)桑葉中含有豐富的多酚、黃酮、多糖、多種維生素等生物活性物質(zhì)，具有降低血糖、延緩衰老、抑菌和抗氧化等功效。桑樹(shù)作為優(yōu)良的生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，對(duì)高溫、干旱、高

3、鹽、低溫等逆境脅迫也具有一定的抗逆性。隨著桑樹(shù)基因組測(cè)序的完成，桑樹(shù)抗逆性的研究已經(jīng)從種質(zhì)資源篩選、生理生化發(fā)展到分子水平。本研究利用生物信息學(xué)方法，從川桑（Morus notabilis）全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到了19個(gè)RALF相關(guān)基因，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、保守基序、上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。同時(shí)，利用qRT-PCR研究了所鑒定得到的基因在桑樹(shù)根、莖、葉等組織中的轉(zhuǎn)錄水平變化，及該基因在機(jī)械損傷、家蠶咬食及茉莉酸甲酯誘

4、導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平變化。本研究獲得如下研究結(jié)果：
　　1、桑樹(shù)RALF基因的鑒定及生物信息學(xué)分析
　　利用生物信息學(xué)的方法，在川?；蚪M中一共鑒定得到19個(gè)RALF基因，分別命名為MnRALF1～MnRALF19。氨基酸長(zhǎng)度介于74aa～164aa之間，分子量大小介于7～19 KD。通過(guò)對(duì)這些川桑RALF基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)除了MnRALF4、MnRALF7、MnRALF10、MnRALF11、MnRALF12等

5、5個(gè)成員以外，其他成員都有信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)除了MnRALF4主要分布在葉綠體中、MnRALF7主要分布于細(xì)胞核中、MnRALF12主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，其他RALF家族成員都主要分布在胞外基質(zhì)中?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示桑樹(shù)RALF基因的內(nèi)含子數(shù)目和位置與其他植物中報(bào)道的相應(yīng)基因的結(jié)果相一致。多種植物 RALF氨基酸多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，C端序列保守性較強(qiáng)。桑樹(shù)RALF主要含有三個(gè)保守基序 Motif1、Motif2、Motif3，二級(jí)結(jié)

6、構(gòu)預(yù)測(cè)顯示川桑 RALF前體蛋白C端以α螺旋為主，在保守氨基酸之間形成少量β折疊結(jié)構(gòu)。由于保守區(qū)富含帶電荷的氨基酸，可能影響成熟蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，且前體蛋白C端延伸區(qū)域的長(zhǎng)度多變,推測(cè)保守區(qū)域可能和多肽與不同受體分子的結(jié)合有關(guān)。
　　包括桑樹(shù)5個(gè)物種共70個(gè)RALF蛋白序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果顯示，該系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)可以分為A、B、C、D四個(gè)類群，川桑RALF蛋白質(zhì)在這4個(gè)類群中都有分布。對(duì)桑樹(shù)RALF基因啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析發(fā)

7、現(xiàn)其主要分為三類：光響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件及激素響應(yīng)元件，據(jù)此推測(cè)桑樹(shù)RALF基因能夠響應(yīng)脅迫和激素反應(yīng)，暗示其在桑樹(shù)防御病蟲(chóng)害、真菌侵染、抗旱等方面可能具有重要的功能。
　　2、桑樹(shù)RALF基因的克隆及組織表達(dá)分析
　　通過(guò)對(duì)鑒定到的川桑RALF前6個(gè)基因成員進(jìn)行克隆，結(jié)果表明這6個(gè)基因在川桑和粵桑兩個(gè)桑樹(shù)種質(zhì)資源中都能擴(kuò)增出條帶，且與預(yù)測(cè)的大小一致。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，這6個(gè)基因在兩個(gè)種質(zhì)資源之間，序列上只有個(gè)別堿基的差異。

8、分別以粵桑根、莖、葉三個(gè)組織為模板，利用qRT-PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異性引物檢測(cè)所鑒定到的19個(gè)桑樹(shù)RALF基因在粵桑上述三個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這19個(gè)RALF基因在粵桑根和莖組織中各有7個(gè)RALF成員表達(dá)量相對(duì)較高，有5個(gè)成員在粵桑葉組織中表達(dá)量相對(duì)較高，暗示 RALF基因在粵桑不同組織間可能有著不同的生理作用。
　　3、桑樹(shù)RALF基因響應(yīng)不同脅迫處理下的表達(dá)模式分析
　　為了研究桑樹(shù)RALF基因?qū)γ{迫誘導(dǎo)處理的響