桑樹PAMP途徑中相關(guān)基因分析和功能研究.pdf

1、高等真核生物識別微生物的侵染主要依賴于一系列的模式識別受體pattern recognitionreceptors（PRRs）。這些PRRs能夠識別出一些病原微生物中保守分子結(jié)構(gòu)-病原相關(guān)分子模式pathogen-associated molecular patterns(PAMPs)。PAMPs在動物先天免疫中扮演著重要的角色，而在植物中，它們同樣作為激發(fā)子激活了防御信號。這種能夠辨別高度保守分子的識別機制可能通過趨同進化在不同生物界

2、獨自出現(xiàn)。植物能夠識別組成真菌細胞壁的幾丁質(zhì)和甾醇麥角固醇，同樣也能夠識別細菌內(nèi)的lipopolysacharides(LPS)、冷擊蛋白(CSP)、鞭毛蛋白和EF-Tu。植物具有多種多樣的病原微生物模式分子(PAMPs)，但是相應(yīng)PRRs、下游的響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和一些相關(guān)的防御蛋白以及它們之間的相互關(guān)系并不是很清楚。
　　桑樹（Morus L.）屬于桑科（Moraceae），為我國重要的經(jīng)濟樹種。我國擁有豐富的桑屬資源，作為家蠶的

3、主要飼料，桑葉生產(chǎn)是蠶桑產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。桑樹病蟲害始終是威脅蠶桑產(chǎn)業(yè)的重要隱患。它們不僅造成桑葉大幅減產(chǎn)，養(yǎng)蠶數(shù)量下滑，同時了制約桑樹在藥用和生態(tài)保護中發(fā)揮重要作用。本文通過研究桑樹PAMP途徑中的基因與功能，篩選出靶標基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證其功能，這對于研究桑樹的抗生物脅迫具有重要的意義。
　　本文研究結(jié)果:
　　1.桑樹中PAMP相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析
　　從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫中共獲得14個LysM蛋白基因、56個W

4、RKY轉(zhuǎn)錄因子、20個幾丁質(zhì)酶基因。通過生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示這些基因家族含有各自保守的蛋白質(zhì)序列，上游調(diào)控序列中都含有一些響應(yīng)植物免疫（JA、SA、真菌、刺激子、傷口）的調(diào)控元件，其中一些蛋白質(zhì)和已經(jīng)報道過的蛋白序列高度相似，所以這些基因可能參與植物的PAMP防御免疫反應(yīng)。
　　2.桑樹PAMP途徑上的關(guān)鍵基因響應(yīng)生物和擬生物脅迫后的表達分析
　　為了探究可能參與PAMP途徑中的各個基因的表達水平是否存在內(nèi)在的聯(lián)系，本論

5、文通過qPCR探究了11個基因在應(yīng)對不同脅迫后的表達變化。結(jié)果顯示:MnCERK1作為PAMP途徑的上游激發(fā)子的識別受體，在受到生物脅迫和擬生物脅迫處理后，MnCERK1基因都不同程度受到誘導(dǎo)表達。幾丁質(zhì)處理和家蠶咬食后，桑樹中的4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子都呈現(xiàn)出不同程度的表達，在以前的報道中，4個轉(zhuǎn)錄因子作為PAMP途徑上的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠響應(yīng)幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)，而昆蟲咬食一般會觸發(fā)JA的免疫途徑，這可能暗示這4個轉(zhuǎn)錄因子在下游參與這兩種免疫途

6、徑，且都是正調(diào)控。植物的幾丁質(zhì)酶一般被認為參與植物的防御。選取6個分屬于不同分類的桑樹幾丁質(zhì)酶，在受到擬生物脅迫時，它們都能夠被誘導(dǎo)上調(diào)表達;而在家蠶咬食后，只有幾丁質(zhì)酶Mnchi16被顯著的誘導(dǎo);真菌處理后，Mnchi8也呈現(xiàn)顯著誘導(dǎo)的表達模式，擬生物和生物脅迫誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的表達存在顯著的差異。
　　3.Mn WRKY29和Mnchil4基因的克隆和煙草遺傳轉(zhuǎn)化
　　為了進一步研究MnWRKY29和Mnchil4是否是PA