桑樹miR393-AFB2-tasiRNA級聯(lián)途徑的鑒定及其功能研究.pdf

1、miRNA-TAS-tasiRNA-target gene級聯(lián)途徑將miRNA和siRNA作用途徑聯(lián)系在一起，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組分，在植物發(fā)育、代謝和脅迫響應(yīng)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究對已獲得的桑樹sRNA、轉(zhuǎn)錄組和降解組數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，桑樹mul-miR393可以靶向切割一種生長素信號F-box蛋白基因（MulAFB2）轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)生多個以21nt為單位的相變siRNAs（ta-siAFB2s）

2、，并通過Northern Blot和定量PCR證明了ta-siAFB2的存在。在此基礎(chǔ)上利用PCR和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究了桑樹MIR393A（MulMIR393A）和MIR393B（MulMIR393B）基因及其靶基因MulAFB2的表達模式和生物學(xué)功能，為揭示桑樹miR393-AFB2-tasiRNA-target gene級聯(lián)途徑的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)，對于促進桑樹功能基因組學(xué)的研究具有重要意義。
　　本文的主要研究結(jié)果如下：

3、　?。?）桑樹miR393-AFB2-tasiRNA級聯(lián)途徑的鑒定
　　利用小RNA靶基因在線分析軟件對桑樹sRNA、轉(zhuǎn)錄組和降解組數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，桑樹miR393可以靶向 MulAFB2轉(zhuǎn)錄本，切割其產(chǎn)生多個以21nt為單位的相變的siRNAs，這些siRNAs符合tasiRNAs的特點，是潛在的tasiRNAs。利用Northern Blot和定量 PCR技術(shù)在桑樹中檢測到了相關(guān) siRNAs的積累，進而證明了桑樹中miR39

4、3-AFB2-tasiRNA級聯(lián)途徑的存在。
　?。?）MulMIR393A和MulMIR393B基因啟動子的克隆及表達特性分析
　　利用PCR技術(shù)分別克隆得到 MulMIR393A和MulMIR393B基因的啟動子序列pMulMIR393A和pMulMIR393B。兩個啟動子序列都含有基因正常轉(zhuǎn)錄起始必需的順式作用元件，同時含有不同的環(huán)境響應(yīng)、植物激素和發(fā)育調(diào)節(jié)等多種響應(yīng)元件。分別構(gòu)建了由pMulMIR393A和pMulM

5、IR393B啟動GUS基因表達的植物表達載體，轉(zhuǎn)入擬南芥植株，利用GUS組織化學(xué)染色和GUS熒光定量技術(shù)分析了 pMulMIR393A和pMulMIR393B的組織表達和誘導(dǎo)表達活性，發(fā)現(xiàn)這兩個啟動子既具有不同的組織表達特異性，又具有不同的植物激素和病原菌誘導(dǎo)表達活性。
　?。?）桑樹MulMIR393A和MulMIR393B的生物學(xué)功能分析
　　將MulMIR393A和MulMIR393B基因轉(zhuǎn)入擬南芥，通過Norther

6、n Blot和定量PCR分析發(fā)現(xiàn)MulMIR393A和MulMIR393B基因均能在轉(zhuǎn)基因植株中高效表達，加工產(chǎn)生的5P成熟體可以靶向擬南芥中的AFB2基因。值得注意的是MulMIR393A和MulMIR393B基因在擬南芥中表達加工生成的5P和3P端成熟體的積累量并不一致，在轉(zhuǎn)MulMIR393A基因植株中5P端成熟體的積累量顯著高于3P端成熟體，而轉(zhuǎn)MulMIR393B基因植株中3P端成熟體的積累量則遠高于5P端成熟體。表型分析發(fā)現(xiàn)

7、轉(zhuǎn) MulMIR393A和轉(zhuǎn)MulMIR393B擬南芥植株的生長表型有明顯不同，并且與野生型相比都有明顯差異，表明MulMIR393A和MulMIR393B對植物生長發(fā)育有不同的調(diào)節(jié)功能。對轉(zhuǎn)基因植株分別接種丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst DC3000）處理，發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)MulMIR393A擬南芥對Pst DC3000的侵染表現(xiàn)出較強的抗性，

8、而轉(zhuǎn) MulMIR393B擬南芥則表現(xiàn)出較強的敏感性。因此，MulMIR393A和MulMIR393B基因可能都參與了植物對Pst DC3000侵染的響應(yīng)過程，但MulMIR393A基因具有正調(diào)控作用，而MulMIR393B基因具有負調(diào)控作用。
　?。?）桑樹miR393靶基因MulAFB2的生物學(xué)功能分析
　　根據(jù)已有的桑樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息設(shè)計引物，擴增得到了MulAFB2基因。MulAFB2 cDNA全長為1772 bp，

9、核苷酸序列在不同物種間同源性較高，miR393靶位點區(qū)核苷酸序列具有很強的保守性。MulAFB2 cDNA編碼573個氨基酸，編碼的氨基酸序列與擬南芥等物種的AFB2蛋白氨基酸序列具有較高的同源性。構(gòu)建了MulAFB2基因的植物表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)MulAFB2植株與野生型擬南芥相比，幼苗根系較短，葉片數(shù)較多，對Pst DC3000的抗性降低。因此，MulAFB2不僅與植物的生長發(fā)育有關(guān)，而且在抗病反應(yīng)過程中可能起