桑樹Phytocystatin基因的鑒定及表達(dá)模式分析.pdf

1、農(nóng)業(yè)害蟲是造成農(nóng)作物減產(chǎn)最重要的原因。目前，關(guān)于害蟲的防治主要采用化學(xué)殺蟲劑和雜交選育抗性品種。然而，過分使用化學(xué)殺蟲劑能使害蟲不斷的產(chǎn)生抗性，使用常規(guī)的劑量不能達(dá)到有效防治的目的，也對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的破壞。雜交選育抗性品種具備經(jīng)濟(jì)、安全等優(yōu)點，但因選育周期長，抗蟲性不穩(wěn)定等因素受到了限制。通過植物轉(zhuǎn)基因工程方法獲得高效穩(wěn)定的抗蟲品系已成為趨勢。因此，在植物中發(fā)現(xiàn)一類能夠有效抵御害蟲的基因很有必要，而蛋白酶抑制劑由于具有有效抑制昆蟲消

2、化蛋白酶和改善食物營養(yǎng)質(zhì)量的能力被作為重要的候選基因。
　　植物Phytocystatins是一類廣泛分布于植物、動物及微生物中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。大多數(shù)鞘翅目昆蟲利用半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行消化，所以Phytocystatins具有抑制鞘翅目昆蟲消化蛋白質(zhì)的能力，而對鱗翅目昆蟲無特異性抑制作用。因此鑒定桑樹中重要的Phytocystatin基因，通過轉(zhuǎn)基因工程獲得對桑天牛(Aprionagermari)等昆蟲防治有效的桑樹新品系具

3、有重要的意義。
　　桑樹（Morus alba L）是一類能夠分泌乳汁的植物，研究報道，桑樹乳汁中的蛋白質(zhì)及次生代謝物質(zhì)參與了抵御昆蟲攝食的過程。使得除家蠶（Bombyx mori）外，自然界中很多昆蟲無法取食桑葉。目前，不同類型蛋白酶抑制劑在其它植物中已得到鑒定。所以鑒定桑樹乳汁中重要的Phytocystatin基因，將為開發(fā)穩(wěn)定高效的殺蟲工具提供新的契機。
　　本研究利用生物信息學(xué)方法，從川桑（Morus notabil

4、is）全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定了Phytocystatin基因。利用qRT-PCR分析桑樹Phytocystatin基因在川桑和廣東桑(Morus atropurpurea)品種粵桑-69851中不同器官間的轉(zhuǎn)錄水平變化。分析了這些基因在茉莉酸甲酯、創(chuàng)傷、咬食誘導(dǎo)后表達(dá)的變化。采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞的方法，獲取了關(guān)鍵基因MaCPI-1編碼蛋白在亞細(xì)胞水平的定位信息。利用Western-blotting技術(shù)對MaCPI-1基因編碼蛋白表達(dá)

5、情況進(jìn)行了確定。本研究所獲得研究結(jié)果如下:
　　1、桑樹Phytocystatin基因的鑒定、克隆及生物信息學(xué)分析
　　利用生物信息學(xué)的方法，在川桑基因組中鑒定得到6個Phytocystatin基因，分別命名為 MnCPI-1、MnCPI-2、MnCPI-3、MnCPI-4、MnCPI-5和MnCPI-6。在川桑和粵桑-69851兩個桑樹品種中均克隆得到了上述6個基因，它們在序列上只存在個別堿基的差異。基因結(jié)構(gòu)分析表明桑樹P

6、hytocystatin基因的內(nèi)含子數(shù)目和位置與其他植物中報道的相應(yīng)基因的結(jié)果一致。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，6個基因編碼的蛋白質(zhì)均含有3個與靶蛋白酶互作的保守基序，說明桑樹Phytocystatins是一類高度保守的蛋白。桑樹與其它物種共51個Phytocystatins采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，該系統(tǒng)發(fā)生樹可以分為A-C三個類群，桑樹的6個基因編碼的蛋白在3個類群中都有分布。其中MnCPI-1、MnCPI-2、MnCPI-3分布于A類群，且

7、具有C端延伸的Phytocystatins都聚在該類群中。MnCPI-6與單子葉植物Phytocystatins聚在B類群中。MnCPI-4、MnCPI-5聚在C類群，該類群Phytocystatins全來自于雙子葉植物。通過分析發(fā)現(xiàn)，具有內(nèi)含子的Phytocystatin基因都聚在A類群中，而單外顯子Phytocystatin基因聚在B、C類群，表明基因結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果具有一致性。
　　17個具有C端延伸的Phytocyst

8、atins構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹表明MnCPI-1與草莓、蘋果等薔薇科植物Phytocystatins聚在一起，與蘋果（Malus×domestica Borkh）和草莓（Fragaria×ananassa Duch）的氨基酸序列一致性分別為75％和70％，重要的保守基序的氨基酸完全一致，暗示它們可能行使相同的功能。多序列比對發(fā)現(xiàn)MnCPI-1 C端延伸的氨基酸序列與其它物種的序列具有很高的一致性。通過位點模型分析，包括桑樹共10個物種中具有C

9、端延伸的基因在整體進(jìn)化中沒有檢測出正選擇，暗示桑樹的MnCPI-1基因可能進(jìn)行中性或純化選擇。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MnCPI-3、MnCPI-4、MnCPI-5與水稻（Oryza sativa）OC-I三級結(jié)構(gòu)相似。一些桑樹Phytocystatins也有獨特的結(jié)構(gòu)，如MnCPI-2缺失了N端第一個β折疊片，MnCPI-6在介于第一、二兩個β折疊片之間多出兩個小折疊片。
　　用plantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測桑樹Phytocystati

10、n基因上游啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點。發(fā)現(xiàn)這些基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點主要包括光響應(yīng)元件，激素響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件三類。暗示其在桑樹防御病蟲害、真菌侵染、抗旱和抗寒等方面具有生物學(xué)功能。
　　2、桑樹Phytocystatin基因表達(dá)分析
　　利用qRT-PCR技術(shù)檢測桑樹Phytocystatin基因在川桑根、莖、花、葉器官及乳汁和粵桑-69851根、莖、葉三個器官的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。結(jié)果表明，川桑中6個Phytocystatin基因

11、至少在一個器官中有表達(dá)，MnCPI-1～MnCPI-4在這5個器官中都有表達(dá)，但在表達(dá)量上存在差異。MnCPI-5在花中特異性的表達(dá)，MnCPI-6在根、莖、花、乳汁中微弱表達(dá)，在葉中基本不表達(dá)?；浬?69851中除MaCPI-5，其余5個基因在根、莖、葉也都表達(dá)，同樣表達(dá)量上存在差異。比較川桑相同的器官間轉(zhuǎn)錄水平，只有MaCPI-3與川桑MnCPI-3相應(yīng)器官中的表達(dá)模式呈現(xiàn)一致。說明Phytocystatin家族基因在川桑與粵桑-6

12、9851兩個品種器官間表達(dá)模式存在差異。
　　相比于其它物種中Phytocystatin基因器官表達(dá)模式，桑樹Phytocystatin基因在器官中的表達(dá)分布較為廣泛。除個別基因存在器官傾向性外，大多數(shù)基因在根、莖、花、葉、乳汁中均有表達(dá)。
　　利用qRT-PCR技術(shù)檢測茉莉酸甲酯、創(chuàng)傷、咬食處理下桑樹Phytocystatin家族基因在粵桑-69851葉片中的轉(zhuǎn)錄水平。除MaCPI-5外，其余5個基因在茉莉酸甲酯、創(chuàng)傷、咬

13、食的誘導(dǎo)下表達(dá)量不同程度上調(diào)，其中在茉莉酸甲酯處理下基因的上調(diào)程度更加明顯。
　　3、MaCPI-1亞細(xì)胞定位及蛋白水平的表達(dá)分析
　　采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞的方法，對MaCPI-1亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有分布。利用Western-blotting分析，受到茉莉酸甲酯、創(chuàng)傷、咬食處理后MaCPI-1蛋白在粵桑-69851幼苗葉片中的表達(dá)模式，結(jié)果表明，正常生理條件下MaCPI-1在粵桑-69851

14、葉片能表達(dá)，也能響應(yīng)茉莉酸甲酯、創(chuàng)傷、咬食的誘導(dǎo)。這與其在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)模式相一致，暗示MaCPI-1可能具有抑制一些特定昆蟲消化蛋白酶的潛能。
　　本研究利用生物信息學(xué)方法，從川桑全基因組數(shù)據(jù)庫鑒定到6個phytocystatin基因，信息學(xué)分析表明，這些基因在序列、結(jié)構(gòu)、保守基序、三維結(jié)構(gòu)上與其它物種相應(yīng)的基因比較都存在較高的保守性，暗示其在功能上的一致性。qRT-PCR分析表明phytocystatin基因在不同器官中均表達(dá)