桑樹MCAX-1和MRD22基因的克隆及序列與表達(dá)分析.pdf

1、本文在本課題組構(gòu)建的桑樹幼葉cDNA文庫的基礎(chǔ)上獲得了2個(gè)ESTs,克隆了桑樹 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白基因和脫水應(yīng)答蛋白基因,并對(duì)獲得的序列進(jìn)行了分析和功能推斷,用脅迫誘導(dǎo)的方法對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。本論文的主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1、桑樹Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白基因CAX的克隆,序列分析及誘導(dǎo)表達(dá)研究
　　植物體內(nèi)的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體在Ca2+介導(dǎo)的營養(yǎng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。選擇桑樹幼葉c

2、DNA文庫中功能注釋為Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體基因CAX的一條EST序列設(shè)計(jì)引物,通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)與反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)在桑品種育7-11的幼葉中克隆獲得該基因的完整序列,命名為MCAX-1(GenBank登錄號(hào):JN716318)。序列分析顯示:MCAX-1全長1784 bp,包括197 bp的5′端非翻譯序列和243 bp的3′端非翻譯序列,含有1個(gè)1344 bp的完整ORF,編碼447個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)

3、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為47.93 kD,等電點(diǎn)為5.67。構(gòu)建的桑樹和其他植物基于Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示:桑樹與鹽地堿蓬(Suaeda salsa)、毛果楊(Populus trichocarpa)蓖麻(Ricinus Communis)等有較近的親緣關(guān)系。半定量RT-PCR分析表明:MCAX-1在桑樹幼芽、嫩葉、根和幼花中表達(dá)量較高,在韌皮部、木質(zhì)部和成熟果實(shí)中的表達(dá)量較低;MCAX-1在低溫脅迫下的表達(dá)量減少

4、,-1℃時(shí)幾乎無表達(dá),在干旱脅迫下的表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間延長逐漸達(dá)到最大值之后再直線降低,在鹽分脅迫初期的表達(dá)量無變化,但脅迫18d時(shí)表達(dá)量明顯降低。初步推測(cè)MCAX-1與桑樹的抗逆性能有一定關(guān)聯(lián)。
　　2、桑樹脫水應(yīng)答蛋白基因MRD22的克隆,序列分析及誘導(dǎo)表達(dá)研究
　　從已構(gòu)建的桑樹幼葉 cDNA文庫得到了一個(gè)編碼桑樹脫水應(yīng)答(Dehydration-responsive Protein)基因的一段序列,通過RACE與RT

5、-PCR結(jié)合首次獲得了這個(gè)基因的完整序列,命名為MRD22(GeneBank登錄號(hào):JQ804833)。序列分析表明,MRD22全長1503bp,存在334bp的5’端非翻譯序列(5’-UTR)和563bp的3’端非翻譯序列(3’-UTR),其開放讀碼框(ORF)長606bp,編碼201個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為54.28KD,等電點(diǎn)為9.35。構(gòu)建的桑樹和其他植物基于脫水應(yīng)答蛋白基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示:桑樹與毛楊果(Popu

6、lus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、茶樹(Camellia sinensis)、棉花(Gossypium hirsutum)與海島棉(Gossypium barbadense)等有較近的親緣關(guān)系。MRD22在低溫脅迫下的表達(dá)量出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài);在干旱脅迫下,MRD22的表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間延長逐漸達(dá)到最大值之后再直線降低;在鹽分脅迫的情況下,基因 MRD22的表達(dá)量處于明顯波動(dòng)狀態(tài),但當(dāng)在264h時(shí)表