青稞blt基因和HVA1基因的克隆和序列分析.pdf

1、青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.），屬禾本科大麥屬，在植物學(xué)上屬于栽培大麥的變種，因其成熟時(shí)籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，故稱(chēng)裸大麥。青稞是青藏高原一年一熟的高寒農(nóng)區(qū)的標(biāo)志性作物，由于青藏高原高寒缺氧、降雨量少、蒸發(fā)量大等惡劣的氣候環(huán)境，低溫和干旱成為制約青稞品質(zhì)和產(chǎn)量提高的重要因素。雖然生長(zhǎng)環(huán)境惡劣，青稞仍然表現(xiàn)出對(duì)逆境很強(qiáng)的適應(yīng)性，因而蘊(yùn)藏了十分豐富的與抗逆相關(guān)的優(yōu)良基因。從這些優(yōu)良基因

2、中挖掘耐旱和耐寒相關(guān)基因以及對(duì)其功能進(jìn)行分析對(duì)青稞的耐逆境脅迫機(jī)理研究和品種耐逆性遺傳改良的研究具有重要意義。
　　為了了解blt4.9和HVA1基因在青稞中的功能，本實(shí)驗(yàn)以青稞品種“昆侖12號(hào)”為材料，分別克隆了耐寒基因blt4.9和耐旱基因HVA1，并通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)了兩個(gè)基因在不同逆境脅迫時(shí)間下的表達(dá)量；成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體1301-blt4.9和1301-HVA1，為下一步的轉(zhuǎn)基因奠定了理論基礎(chǔ)。具體結(jié)果

3、如下：
　?。?）blt4.9基因全長(zhǎng)738bp，其中包括348bp的開(kāi)放閱讀框，編碼115個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量11.2kD，理論pI值9.04，不穩(wěn)定系數(shù)28.41，是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)；該蛋白富含Ala、Ser、Val、Gly等氨基酸，不含Trp、Glu和Phe氨基酸，這和已報(bào)道的其他冷誘導(dǎo)基因的氨基酸組成相似；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得到blt4.9基因編碼的蛋白質(zhì)含有大量α螺旋（48.7％），從第5-29個(gè)氨基酸有一個(gè)跨膜蛋白；總平均

4、親水性0.597，是一個(gè)高度疏水性蛋白質(zhì)；序列比對(duì)顯示該基因編碼的氨基酸和大麥LTP家族基因有高度同源性，和粳稻的同源性較遠(yuǎn)。通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)了blt4.9基因在低溫（4℃）不同脅迫時(shí)間下的表達(dá)量，用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法和SPSS分析結(jié)果得到隨著脅迫時(shí)間的增加，blt4.9基因的表達(dá)量逐漸增加，且12h、24h和48h的表達(dá)量與對(duì)照（0h）差異顯著（p＜0.05）。用BamHI和SacI兩個(gè)內(nèi)切酶分別酶切質(zhì)粒blt4.9-T和p

5、CAMBIA1301，將blt4.9基因插入pCAMBIA1301多克隆位點(diǎn)中，成功構(gòu)建了1301-blt4.9植物表達(dá)載體，為青稞遺傳轉(zhuǎn)化和抗寒分子設(shè)計(jì)育種的研究奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）HVA1基因全長(zhǎng)695bp，其中包括642bp的開(kāi)放閱讀框，編碼213個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量21.8kD，理論pI值9.04，不穩(wěn)定系數(shù)17.09，是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)；其中Ala、Thr、Lys三種氨基酸最多，超過(guò)總蛋白含量的52%；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

6、得到HVA1基因編碼的蛋白質(zhì)含有大量α螺旋（77%），總平均親水性-1.048，是一個(gè)高度親水無(wú)跨膜蛋白的小分子量蛋白質(zhì)。序列比對(duì)顯示，HVA1基因與大麥的HVA1基因同源性最高，達(dá)到99.5%。通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)HVA1基因在干旱不同脅迫時(shí)間下的表達(dá)量，用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法和SPSS分析，結(jié)果表明，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，HVA1基因表達(dá)量逐漸增加，8h和12h的表達(dá)量比0h明顯增加，且差異顯著（p＜0.05）。最后，用Bam