大腹園蛛拖絲蛋白基因的克隆和序列分析.pdf

1、蜘蛛可產(chǎn)生七種絲和膠粘物,其化學本質(zhì)均為蛋白質(zhì)。其中蜘蛛拖絲將高強度和高彈性集于一體,是最優(yōu)良的天然蛋白質(zhì)纖維,被譽為“生物鋼”。在蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有四個特征性的氨基酸序列motifs,這四個氨基酸序列motifs以多個數(shù)量、多種組合和多次重復的形式存在。由于構(gòu)成蜘蛛拖絲蛋白基因的核苷酸序列高GC含量(局部區(qū)域可達80％),且具有大量的重復性序列,因而以基因組DNA為模板進行PCR擴增或以mRNA為模板進行RT-PCR擴增拖

2、絲蛋白基因時,設計特異性引物是相當困難的,PCR擴增產(chǎn)物極易出現(xiàn)梯形的多條DNA帶。實際擴增中由于模板和引物的競爭作用,使得基因擴增提前終止,只能得到較短的DNA片段,因而到目前為止,編碼蜘蛛拖絲蛋白基因的大小尚未確定,尚未獲得編碼蜘蛛拖絲蛋白基因的完整克隆,蛋白表達的研究也進展緩慢。任洪林等采用構(gòu)建cDNA文庫的方法僅獲取了大腹園蛛拖絲蛋白約1.7kb的部分編碼序列;Beckwitt等進行PCR擴增雙世紀園蛛的基因組DNA,僅獲得了約

3、300bp和700bp的拖絲蛋白基因片段。本論文選取大腹園蛛作為研究對象,解剖分離出大腹園蛛主壺腹腺體,提取基因組DNA和總RNA,設計合成了很多對引物,采用常規(guī)PCR、多重PCR、熱啟動PCR等方法進行擴增,并根據(jù)實驗結(jié)果最終確定了長距離PCR反應對復雜基因的擴增。通過多種引物對實驗、MgCl2濃度梯度實驗、引物濃度梯度實驗、退火溫度梯度實驗、延伸時間梯度實驗、touch down循環(huán)等實驗對PCR以及RT-PCR反應條件進行優(yōu)化,以

4、擴增大腹園蛛拖絲蛋白基因。凝膠純化、回收擴增獲得的大腹園蛛拖絲蛋白基因DNA,克隆于pDrive載體,篩選轉(zhuǎn)化子,并經(jīng)PCR、酶切和序列分析鑒定陽性克隆。將其中的一個克隆基因片段構(gòu)建入pET32a(+)蛋白表達載體。本論文以DNA為模板,通過PCR擴增獲得了編碼大腹園蛛拖絲蛋白基因的克隆AvDS1,序列長2199bp,序列分析表明不含基因內(nèi)含子;通過RT-PCR,獲得了編碼大腹園蛛拖絲蛋白基因的克隆AvRS2,序列長951bp;序列比較

5、分析推測大腹園蛛拖絲蛋白基因存在著兩種組分,AvRS2克隆為編碼大腹園蛛拖絲蛋白基因組分-1,AvDS1克隆可能為大腹園蛛拖絲蛋白基因的另一組分-2。獲得了可以表達大腹園蛛拖絲蛋白基因AvRS2的pET-RS2表達載體。這些成果有助于進一步研究大腹園蛛拖絲蛋白基因的基因組成和結(jié)構(gòu)特征、為應用蛋白質(zhì)剪接技術(shù)開發(fā)蜘蛛拖絲蛋白的研究提供了基因克隆,構(gòu)建的表達載體為進一步研究蜘蛛拖絲蛋白基因的表達、表達蛋白的結(jié)構(gòu)以及應用表達蛋白進行人工紡絲奠定