Intein介導(dǎo)的天然大腹園蛛MiSp重復(fù)區(qū)基因在畢赤醇母的表達(dá)研究.pdf

1、蜘蛛絲(Spider silk)是一種天然蛋白纖維材料，因其卓越的材料學(xué)性質(zhì)被廣泛認(rèn)知。同時(shí)，作為一種生物大分子多聚物，有著良好的生物兼容性且易于生物降解，被越來(lái)越多的用于藥載運(yùn)輸和細(xì)胞組織工程等多領(lǐng)域的研究。圓網(wǎng)蜘蛛可分泌六種蛛絲纖維，其中次壺腹腺絲（又稱(chēng)臨時(shí)捕獲絲）主要用于加固蛛網(wǎng)和捕獵等，具有和牽引絲相似的優(yōu)良品質(zhì)，但不同的是，在水環(huán)境中臨時(shí)捕獲絲不發(fā)生超收縮現(xiàn)象，這一特點(diǎn)使其具有特殊的應(yīng)用價(jià)值。但是，由于蜘蛛自身同類(lèi)相殘的習(xí)性，

2、以及產(chǎn)絲量小的特點(diǎn)，無(wú)法通過(guò)大規(guī)模人工飼養(yǎng)的方法來(lái)獲取蛛絲纖維。隨著基因工程的快速發(fā)展，越來(lái)越多研究嘗試?yán)没蛑亟M表達(dá)和后期放生的方法來(lái)獲取人造蛛絲
　　為了進(jìn)一步解析蛛絲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，探索蛛絲蛋白成絲機(jī)理，制備良好的仿生材料儲(chǔ)備大量可溶蛛絲蛋白。本課題旨在酵母表達(dá)體系中分段表達(dá)次壺腹腺絲基因，之后通過(guò)intein介導(dǎo)的體外拼接技術(shù)，獲得天然的全長(zhǎng)次壺腹腺絲蛋白產(chǎn)物。為此，本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得大腹園蛛Misp天然基因，以

3、其內(nèi)部intron為界分為兩段，分別融合his-tag及split-intein的N端或C端，構(gòu)建了4對(duì)不同的表達(dá)克隆。嘗試在Pichia pastoris表達(dá)，優(yōu)化，純化，獲得較高表達(dá)水平，進(jìn)而通過(guò)split-intein的體外剪接，將兩段蛋白產(chǎn)物以肽鍵連接起來(lái)，以期獲得全長(zhǎng)蛋白。
　　本研究中，采用兩種菌株、兩種intein成功構(gòu)建了4對(duì)克隆并在Pichia pastoris實(shí)現(xiàn)其中一對(duì)GS115:P1-SXN，GS115:P

4、2-SXC表達(dá)，純化。
　　在對(duì)P1-SXN序列表達(dá)的過(guò)程中，在Pichia pastoris中摸索表達(dá)條件，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化;同時(shí)，在E.coi1中和實(shí)現(xiàn)了對(duì)照組BL21(DE3):P1-PKT的表達(dá)，并以此作為參照，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot analysis，比對(duì)了兩種表達(dá)系統(tǒng)Pichia pastoris和E.coi1對(duì)Misp天然基因表達(dá)情況。結(jié)果表明P1-SXN在兩種表達(dá)系統(tǒng)中均可實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，而GS

5、115經(jīng)初步優(yōu)化，表達(dá)產(chǎn)量能達(dá)到原來(lái)的6-7倍，是BL21(DE3)的2-3倍，而純化效率是BL21(DE3)的5-7倍。由此證明，Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)更適合重復(fù)度高以及富含Gly/Ala的天然蛛絲編碼基因的表達(dá)。
　　同時(shí)，在對(duì)GS115:P2-SXC表達(dá)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于其攜帶的intein:sx-s0的原因，容易出現(xiàn)斷裂等現(xiàn)象，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。因此本研究需要繼續(xù)嘗試另外3對(duì)克隆的表達(dá)，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，