大腹圓蛛基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建及其拖絲蛋白基因的雜交篩選.pdf

1、蜘蛛屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)，是蛛形綱(Arachnoidea)中最大的一類，約36000種，我國(guó)已記錄蜘蛛2361種。所有蜘蛛都能紡絲，蜘蛛絲是天然絲纖維中最細(xì)的絲，具有特殊的結(jié)構(gòu)，在許多方面都表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)良品質(zhì)，如強(qiáng)度大、彈性好、韌性強(qiáng)、耐沖擊、耐疲勞，而且密度低、抗輻射，具有可濕性、耐火、耐熱、耐低溫，無(wú)論是在干燥狀態(tài)還是潮濕狀態(tài)都表現(xiàn)出很好的性能：由于蜘蛛絲是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，具有生物可降解性，是可循環(huán)再生的材料，因而

2、對(duì)環(huán)境是友好的。 由于蜘蛛具有同類相食的特性，難以密集飼養(yǎng)，限制了蜘蛛絲蛋白的廣泛應(yīng)用。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)大量獲得蜘蛛絲已經(jīng)成為當(dāng)前生物學(xué)研究的主要目標(biāo)。在我國(guó)，分布最廣、蛛絲性能極佳的當(dāng)屬大腹圓蛛(Araneusventricosus)，雖然已有一些科研人員對(duì)其進(jìn)行了研究，但還沒(méi)有得到拖絲蛋白編碼基因的全長(zhǎng)序列。為了獲得大腹圓蛛拖絲蛋白編碼基因，本論文從以下方面進(jìn)行研究： 首先，通過(guò)大量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，建立了適合蜘蛛基因

3、組DNA的提取方法——尿素裂解法。該方法簡(jiǎn)單便捷，成本低，無(wú)需液氮研磨，可在常溫下進(jìn)行，裂解過(guò)程中不形成沉淀，呈懸浮狀，不用顛倒混勻，避免了流體剪切力對(duì)高分子量DNA的剪切作用，完整性好，提取的DNA大小遠(yuǎn)在23kb以上，更適合高分子量基因組DNA的提??；DNA得率高，每毫克蜘蛛附肢肌肉可提取出150ng左右的高分子量基因組DNA，無(wú)蛋白質(zhì)污染，滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。 將提取的基因組DNA隨機(jī)斷裂成約40kb的片段，經(jīng)過(guò)末端

4、補(bǔ)齊、5’端磷酸化后，用瓊脂糖凝膠分離、純化，連入CopyControlpCC2FOSTM載體，通過(guò)MaxPlaxTMLambdaPackagingExtracts包裝，轉(zhuǎn)入EPI300TM—TlRE．coli，成功構(gòu)建了無(wú)偏向性、覆蓋大腹圓蛛全部基因的Fosmid文庫(kù)，其包裝滴定度達(dá)8.0×104。根據(jù)已經(jīng)公布的蜘蛛拖絲基因特征序列，設(shè)計(jì)并合成了位于拖絲蛋白N端、中間重復(fù)區(qū)和C端的特異性雜交引物，經(jīng)[α-32P]dCTP標(biāo)記后進(jìn)行反復(fù)

5、原位雜交。以中間重復(fù)區(qū)雜交引物重復(fù)雜交2次，在大約4.8×105個(gè)菌落中篩選出約1.3×103個(gè)陽(yáng)性克隆；再以C端特異性雜交引物對(duì)上述1.3×103個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行雜交，得到82個(gè)清晰的陽(yáng)性斑；最后，以N端特異性雜交引物在上述結(jié)果中篩選出12個(gè)陽(yáng)性克隆。從理論上講，這12個(gè)陽(yáng)性克隆應(yīng)該含有大腹圓蛛拖絲蛋白的全長(zhǎng)編碼基因，雖然雜交存在一定的假陽(yáng)性，至少會(huì)包含部分編碼基因，其它陽(yáng)性克隆也會(huì)含有拖絲蛋白的部分編碼基因。用鳥(niǎo)槍法隨機(jī)測(cè)序，得到了4