桑樹MLX56基因家族生物信息學(xué)及表達(dá)分析.pdf

1、桑樹（Morus alba L.）是重要的雙子葉木本經(jīng)濟(jì)作物之一，廣泛分布在熱帶及溫帶地區(qū)。桑葉作為家蠶最佳的天然飼料，是蠶桑產(chǎn)業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。桑椹，是桑樹的果實(shí)，味道甘甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，既可作為功能食品開發(fā)的原料，又可作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，應(yīng)用前景廣闊。
　　桑樹乳汁中的次生代謝產(chǎn)物質(zhì)及防御蛋白，具有抑菌抗蟲作用。桑樹乳膠蛋白基因在抗蟲防御過程中起著重要的作用。2009年，Konno從桑樹乳汁中純化鑒定到一個(gè)56 KDa的防御蛋白

2、，命名為MLX56蛋白。從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索MLX56基因同源序列，并進(jìn)行基因進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)及基因的表達(dá)分析，為桑樹MLX56基因的功能研究及利用奠定基礎(chǔ)。本研究利用桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，采用生物信息學(xué)方法，分析桑樹MLX56基因家族結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系，并對(duì)MLX56基因家族成員進(jìn)行鑒定;利用MEGA4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析;通過差異表達(dá)分析及半定量PCR技術(shù)研究MLX56基岡在不同桑樹種質(zhì)材料及不同組織中的表達(dá)水平;構(gòu)建原核表達(dá)載體p

3、ET28a-MLX56-6，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，在28℃，0.5 mmol·L1IPTG條件下誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間段融合蛋白的表達(dá)情況，并將高效表達(dá)時(shí)段的菌液進(jìn)行超聲破碎，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的可溶性;使用Western Blot驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá);同時(shí)研究該基因?qū)Υ竽c桿菌生長(zhǎng)速率的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1、桑樹MLX56基因家族克隆及生物信息學(xué)分析<

4、br>　　利用桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定到6個(gè)MLX56家族基因，為串聯(lián)重復(fù)序列，6個(gè)桑樹MLX56基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)約2000 bp，其中，4個(gè)MLX56基岡內(nèi)含子數(shù)為1，另外2個(gè)MLX56基因含有2個(gè)內(nèi)含子。另外，還克隆了1個(gè)新的MLX56基因，命名為MLX56-7（GenBank登錄號(hào)為KJ496133）。結(jié)構(gòu)域分析顯示該家族基因含有2個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域，在兩個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域之間有一段伸展蛋白區(qū)域，MLX56基因都含有信號(hào)肽，屬于分泌蛋白。通

5、過NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)桑樹MLX56基因家族編碼的氨基酸序列與西洋接骨木類橡膠蛋白同源性最高，同源性達(dá)66％，與茶樹幾丁質(zhì)酶、葡萄幾丁質(zhì)酶同源性較低，同源性分別為49％和48％。
　　2、桑樹MLX56基因家族在18份桑樹種質(zhì)材料及廣東桑‘桂優(yōu)62號(hào)'不同組織中的表達(dá)水平
　　根據(jù)MLX56基因家族7個(gè)成員伸展區(qū)域的不同設(shè)計(jì)通用引物，以不同桑樹種質(zhì)材料幼葉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。核酸PAGE電泳分析表明MLX56

6、基因在18份桑樹種質(zhì)材料中的表達(dá)存在差異，組織特異性分析顯示MLX56基因在廣東?！饍?yōu)62號(hào)'不同組織中的表達(dá)也存在差異。半定量PCR分析表明，MLX56-2和MLX56-4在18份桑樹種質(zhì)材料中均有表達(dá)，MLX56-3基因在18份桑樹種質(zhì)材料中沒有表達(dá)，MLX56-1 MLX56-5, MLX56-6, MLX56-7僅在部分桑樹種質(zhì)材料中表達(dá);組織表達(dá)特異性分析表明MLX56-2，MLX56-4，MLX56-5，MLX56-6和M

7、LX56-7基因在廣東?！饍?yōu)62號(hào)'各個(gè)組織中都有表達(dá)，MLX6-1基因僅在葉柄及莖中表達(dá)，MLX56-3基因在廣東?！饍?yōu)62號(hào)'各個(gè)組織中都沒有檢測(cè)到表達(dá)。
　　3、桑樹MLX56-6基岡原核表達(dá)分析及大腸桿菌生長(zhǎng)速率測(cè)定
　　原核表達(dá)結(jié)果表明，MLX56-6蛋白在終濃度為0.5 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá);融合蛋白主要以包涵體形式存在;Western Blot分析證實(shí)人腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)了一