犬細(xì)小病毒LM株的序列分析及VP2基因的真核表達(dá).pdf

1、犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬。可引起犬出血性腹瀉和心肌炎，使白細(xì)胞大量減少，在幼犬中的發(fā)病率和死亡率都很高。是危害養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。
　　 本研究對(duì)CPV-LM株病毒進(jìn)行傳代培養(yǎng)，對(duì)形態(tài)學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)等進(jìn)行鑒定及分析。在F81細(xì)胞上培養(yǎng)病毒，病毒可大量增殖，使細(xì)胞發(fā)生腫脹、變圓、破碎、脫落等細(xì)胞病變；電鏡觀察病毒粒子呈立體對(duì)稱，直徑為20 nm，無(wú)囊膜；能凝集

2、豬紅細(xì)胞，第4代病毒的血凝效價(jià)為210，血凝能被抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體所抑制；免疫酶染色試驗(yàn)說(shuō)明病毒感染了F81細(xì)胞并能與已知犬細(xì)小病毒單抗反應(yīng)。
　　 采用PCR方法對(duì)CPV-LM株分5段進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序拼接后得到包括3’端回文結(jié)構(gòu)及所有閱讀框架的長(zhǎng)約4974 bp基因組。對(duì)犬細(xì)小病毒基因進(jìn)行核苷酸序列分析，根據(jù)CPV的分型依據(jù)推斷CPV-LM株為CPV-2型。對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白NS基因分析發(fā)現(xiàn)核苷酸突變位點(diǎn)較多，但多為同義密碼子突變

3、，與參考株比較同源率可達(dá)99％以上。對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因分析發(fā)現(xiàn)其所編碼氨基酸發(fā)生突變347A→T、562V→L、564S→N和568G→A；CPV-LM與Vac1株、CPV-Cv株、388/05-3株和CPVint株屬同一分支，與所選的CPV-2型毒株比較其核苷酸序列的同源率在99％以上，與其他抗原型毒株的同源率也都在97.9％以上。
　　 將VP2基因插入真核表達(dá)載體pEGFP-C1，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-VP2。重組

4、質(zhì)粒與空載體質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72 h后在熒光顯微鏡下可見(jiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中出現(xiàn)顆粒狀綠色熒光，說(shuō)明pEGFP-VP2發(fā)生了瞬時(shí)表達(dá)，證明VP2基因具有正確的閱讀框。
　　 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增VP2基因，得到VP2（BamHⅠ/EcoRⅠ）和VP2（BamHⅠ/XhoⅠ），將兩段VP2基因分別插入桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac1和pFastBac HT。構(gòu)建了4種重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，分別命名為pFastBac1-VP2（

5、BamHⅠ/EcoRⅠ）、pFastBac1-VP2（BamHⅠ/XhoⅠ）、pFastBac-HT-VP2（BamHⅠ/EcoRⅠ）和pFastBac-HT-VP2（BamHⅠ/EcoRⅠ）。將其分別轉(zhuǎn)座入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，提取Bacmid DNA，獲得4種相應(yīng)的重組Bacmid，分別轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，獲的重組桿狀病毒，命名為：rBV-VP2（B/E）、rBV-VP2（B/X）、rBV HT-VP2（B/E）和rBVHT-V

6、P2（B/X）。通過(guò)免疫酶染色、SDS-PAGE和Western-blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明4種重組Bacmid在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中均得到了表達(dá)，并具有反應(yīng)活性。
　　 本研究對(duì)CPV-LM株進(jìn)行生物學(xué)鑒定，用PCR方法克隆得到了包括3’端回文結(jié)構(gòu)及涵蓋所有閱讀框架的長(zhǎng)為4974 bp的基因組序列，豐富了CPV基因庫(kù)信息，為CPV的感染性克隆奠定基礎(chǔ)；對(duì)主要衣殼蛋白VP2基因進(jìn)行序列分析，為探索CPV抗原漂變奠定了基礎(chǔ)；借助于桿狀病