犬GM-CSF對犬細(xì)小病毒VP2 DNA疫苗免疫增強(qiáng)作用的研究.pdf

1、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是由T細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的,是重要的造血生長因子和免疫調(diào)節(jié)因子,能促進(jìn)前體細(xì)胞的存活、增殖、分化,促進(jìn)粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞分化與形成集落。GM-CSF具有招募樹突狀細(xì)胞(DC)、單核細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞到抗原注射位點的功能,同時在促進(jìn)樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用。因此GM-CSF被認(rèn)為是一個新一代高效的分子免疫佐劑。犬細(xì)小病毒基因組編碼的VP2蛋白是

2、該病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制備的DNA疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。為進(jìn)一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本實驗利用犬粒細(xì)胞.巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因作為生物佐劑其對犬細(xì)小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
　　 首先通過RT-PCR方法從犬淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增GM-CSF基因,并將其插入到pcDNA3.1載體上,分別構(gòu)建該基因的兩個真核表達(dá)載體:不融合標(biāo)簽的表達(dá)載體pcDNA-cGM-CSF和與Myc

3、-His融合的表達(dá)載體pcDNA-cGM-CSF/MH。用pcDNA-cGM-CSF/MH載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時表達(dá),通過Western-blot試驗證明GM-CSF能夠在真核細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá)。然后用本室構(gòu)建的犬細(xì)小病毒VP2基因表達(dá)載體與pcDNA-cGMCSF共同免疫小鼠(pcDNA3.1空載體作為陰性對照)。免疫后用ELISA方法檢測不同時間小鼠血清的抗體滴度。用MTT法檢測小鼠免疫后35d淋巴細(xì)胞的增殖活性,同時用