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文檔簡介
1、目的:利用2型重組腺相關病毒載體介導FasL基因轉導大鼠骨髓來源DC和活體腎臟,觀察轉導后FasL基因的表達,為進一步研究FasL轉基因在同種異體器官移植中的作用奠定基礎。 方法:1.構建穿梭質粒pSNAV2.0-FasL-IRES-EGFP,通過脂質體轉染BHK-21細胞,經(jīng)G418篩選,獲得載體細胞株BHK/FasL-IRES-EGFP;2.利用重組1型單純皰疹病毒(HSV1-rc/△UL2)感染載體細胞,獲得重組腺相關病毒
2、;3.通過氯仿抽提、冰乙醇沉淀法純化、濃縮重組腺相關病毒,SDS-PAGE檢測其純度,地高辛標記探針點雜交測定其滴度;4.重組腺相關病毒載體介導FasL基因轉導原代培養(yǎng)的大鼠骨髓來源DC,RT-PCR、流式細胞儀、熒光顯微鏡檢測其表達;5.用生理鹽水或重組腺相關病毒經(jīng)腎動脈灌注大鼠左腎,并使之于左。腎內滯留45分鐘,3周、5周、7周后處死大鼠取腎臟標本,通過RT-PCR、HE染色和ICH,檢測FasL表達以及評價腎臟的組織形態(tài)變化。
3、 結果: 1.成功構建了穿梭質粒pSNAV2.0-FasL-IRES-EGFP; 2.獲得了重組腺相關病毒,經(jīng)純化、濃縮后,SDS-PAGE檢測其純度達98%以上,地高辛標記點雜交測定其滴度為1×10<'12>vg/ml; 3.rAAV2-FasL-IRES-EGFP轉導大鼠骨髓來源的DC,48小時后才可以觀察到綠色熒光蛋白的表達,隨著時間的延長逐漸增多,至第7天左右,到達高峰,以后維持這一水平;通過流式細胞
4、儀檢測最高峰時DC表面GFP的表達效率為18%左右;同時通過RT-PCR也證實了FasL基因的表達; 4.rAAV2-FasL-IRES-EGFP轉導活體腎臟后,HE染色證實其未引起腎臟組織的異常形態(tài)學改變;RT-PCR和ICH證實了FasL 基因表達但局限于腎小管上皮細胞。 結論 1.成功制備了FasL基因重組2型腺相關病毒; 2.rAAV介導的FasL基因成功轉導大鼠骨髓來源的DC,效率較低,但基因的
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