質(zhì)粒輔助2型重組腺相關(guān)病毒的制備及其針對(duì)腦缺血和膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因治療的改建.pdf

1、基因治療首要的關(guān)鍵技術(shù)是如何將目的基因輸送并進(jìn)入到特定的靶細(xì)胞,使之高效的表達(dá)外源基因,因而對(duì)基因治療載體的選擇一直是困擾基因治療深入研究的難題.自七十年代末提出病毒載體的概念以來,應(yīng)用于基因治療研究的缺陷性病毒載體種類越來越多,應(yīng)用也越來越廣泛.但是,單純皰疹病毒載體的神經(jīng)毒性,腺病毒載體的免疫原性和逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)整合的致癌性均限制了它們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用.RAAV載體以其安全性好、宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高等幾方面的突出優(yōu)勢(shì)而倍

2、受關(guān)注,是目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的良好載體.但是,rAAV制備困難,是目前阻礙以rAAV為載體進(jìn)行基因治療研究的難題之一.現(xiàn)在所采用的rAAV的制備方法操作復(fù)雜,對(duì)設(shè)備要求高,在普通實(shí)驗(yàn)室難以完成.如何優(yōu)化一種簡(jiǎn)便易行,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高,可滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的需要,在普通實(shí)驗(yàn)室就可以完成的rAAV的重組和純化方案對(duì)rAAV為載體的基因治療的研究有重要的推動(dòng)作用.此外,通用型的rAAV并不能很好的滿足缺血性腦血管病和腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因治療的需

3、要.通用型CMV啟動(dòng)子的腺相關(guān)病毒載體長(zhǎng)期表達(dá)目的基因,對(duì)腦缺血進(jìn)行基因治療時(shí)會(huì)導(dǎo)致血管過度增生和促進(jìn)潛在腫瘤生長(zhǎng),在基因治療的安全性方面存在一定的缺陷,如果改進(jìn)病毒載體啟動(dòng)子,使目的基因僅在腦缺血時(shí)表達(dá),就可以在安全性方面取得更加良好的效果.而在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤治療方面:神經(jīng)元對(duì)rAAV的親和能力比膠質(zhì)細(xì)胞強(qiáng),因此對(duì)于毒性基因治療膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤必須采用膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的rAAV,來實(shí)現(xiàn)毒性基因的選擇性表達(dá).基于以上原因,該課題對(duì)質(zhì)粒輔助2

4、型重組腺相關(guān)病毒的制備及其針對(duì)腦缺血和膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因治療的改建進(jìn)行了研究.質(zhì)粒輔助2型重組腺相關(guān)病毒制備方法的優(yōu)化:該研究采用質(zhì)粒輔助腺相關(guān)病毒重組系統(tǒng),通過磷酸鈣質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法,在HEK293T細(xì)胞內(nèi)合成rAAV,通過氯仿-PEG8000/NaCl-氯仿法接合超濾純化rAAV病毒.通過蛋白電泳和Western雜交檢測(cè)病毒外鞘蛋白,斑點(diǎn)雜交和病毒轉(zhuǎn)染檢測(cè)病毒的物理和生物滴度證實(shí)優(yōu)化后的該方法可以獲得高滴度的rAAV,可滿足小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的

5、需要,對(duì)儀器設(shè)備要求不高,在普通實(shí)驗(yàn)室均可完成.低氧啟動(dòng)rAAV的構(gòu)建:通過酶切連接和PCR等分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用6×HRE CMVmp低氧啟動(dòng)子代替CMW啟動(dòng)子構(gòu)建了pAAV-6×HRE CMV-mp質(zhì)粒,通過優(yōu)化的病毒重組和純化方法制備了低氧啟動(dòng)rAAV-VEGF病毒.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證實(shí):低氧啟動(dòng)rAAV-VEGF病毒僅在低氧時(shí)表達(dá)VEGF蛋白,而且隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)VEGF表達(dá)量增加,同時(shí)通過血管通透性試驗(yàn)證實(shí)表達(dá)的VEGF165

6、蛋白可以分泌到細(xì)胞外,并具有生物活性.低氧啟動(dòng)rAAV-VEGF165的構(gòu)建,為缺血性腦血管病的基因治療提供了安全的基因治療載體.膠質(zhì)細(xì)胞特異性rAAV的構(gòu)建:通過酶切連接和PCR等分子生物學(xué)技術(shù)采用6×HRE-GFAP膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子代替CMV啟動(dòng)子構(gòu)建了pAAV-6×HRE GFAP質(zhì)粒,通過優(yōu)化的病毒重組和純化方法制備了膠質(zhì)細(xì)胞特異性rAAV-VEGF病毒.采用膠質(zhì)細(xì)胞啟動(dòng)子后,病毒的包裝在ITR和Rep蛋白的調(diào)控下進(jìn)行,不表