Neuritin重組腺相關(guān)病毒2修復(fù)大鼠受損視神經(jīng)的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，由于其特殊的解剖生理特性成為研究中樞神經(jīng)損傷和再生的理想部位。研究視神經(jīng)損傷后的再生，不僅對(duì)視神經(jīng)損傷的治療，同時(shí)也對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷后的治療及功能恢復(fù)有著重要的意義。臨床上治療視神經(jīng)損傷的方法主要有藥物治療、視神經(jīng)管減壓手術(shù)、電針和針灸等，但受損神經(jīng)難以再生。視神經(jīng)損傷后會(huì)引起視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(RGCs)的逐漸凋亡、內(nèi)在再生能力低下及軸突的再生抑制性微環(huán)境等問題。目前促進(jìn)受損視神經(jīng)再

2、生的方法主要有:周圍神經(jīng)移植、細(xì)胞移植、添加神經(jīng)營養(yǎng)因子和基因治療等;找準(zhǔn)靶分子，應(yīng)用基因治療視神經(jīng)損傷是近年來研究的熱點(diǎn)，極富應(yīng)用前景。重組腺相關(guān)病毒2(AAV2)是用于眼部最安全、合適的載體，且研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突起素（Neuritin，Nrn1）具有獨(dú)特的神經(jīng)營養(yǎng)作用。本課題采用大鼠的視神經(jīng)壓榨傷模型，以Nrn1為靶分子，研究Nrn1對(duì)視神經(jīng)損傷后RGCs存活和軸突再生的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　(1)構(gòu)建Neuriti

3、n重組腺相關(guān)病毒2質(zhì)粒并包裝測(cè)定其滴度。
　　(2)玻璃體注射及視神經(jīng)壓榨傷模型制作:用微量注射器吸取按照每只眼球2μl的rAAV2-EGFP、rAAV2-Nrn1-EGFP或者生理鹽水注射到大鼠的玻璃體腔，4周后用Yasargil動(dòng)脈瘤夾在大鼠視神經(jīng)眼球后2mm處夾傷9s，2周后經(jīng)心臟灌注取材。
　　(3)采用免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)rAAV2在視網(wǎng)膜中轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型以及轉(zhuǎn)染RGCs的效率。
　　(4)采用Real-ti

4、me PCR和Western blot檢測(cè)Nrn1在各組視網(wǎng)膜中mRNA和蛋白的表達(dá)變化。
　　(5)采用HE染色、免疫組織化學(xué)、CTB追蹤和TUNEL檢測(cè)視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達(dá)對(duì)RGCs存活、凋亡的作用。
　　(6)采用RITC標(biāo)記和透射電鏡檢測(cè)視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達(dá)對(duì)視神經(jīng)軸突再生的作用。
　　(7)采用瞳孔對(duì)光反射和閃光視覺誘發(fā)電位檢測(cè)視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達(dá)對(duì)視覺功能恢復(fù)的作用。

5、r>　　(8)采用Western blot檢測(cè)視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子pAkt1、pAkt2、pErk1/2和pStat3表達(dá)的作用，同時(shí)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Bcl-2和Bax、Caspase3和Cleaved Caspase3表達(dá)的作用。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建Neuritin重組腺相關(guān)病毒2的質(zhì)粒，測(cè)得的rAAV2-EGFP病毒滴度為2.24×1012vg/ml，rAAV2-

6、Nrn1-EGFP病毒滴度為2.34×1012vg/ml。
　　(2)成功注射Neuritin重組腺相關(guān)病毒2，4周后視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示視網(wǎng)膜大部分細(xì)胞和神經(jīng)纖維表達(dá)綠色熒光;免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示rAAV2-EGFP轉(zhuǎn)染約70％的RGCs，且?guī)缀醪晦D(zhuǎn)染RGCs層的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　(3)成功在視網(wǎng)膜內(nèi)過表達(dá)Nrn1，Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示rAAV2-Nrn1-EGFP組中Nrn1

7、mRNA和蛋白含量分別約為rAAV2-EGFP組的19倍和2.3倍; ONC/rAAV2-Nrn1-EGFP組Nrn1 mRNA和蛋白含量分別約為ONC/rAAV2-EGFP組的6倍和2倍。
　　(4)視網(wǎng)膜Nrn1過表達(dá)對(duì)RGCs存活、視神經(jīng)軸突再生和視覺功能恢復(fù)的作用:HE染色結(jié)果顯示RGCs層細(xì)胞存活數(shù)量增多，gamma synuclein免疫組織化學(xué)和CTB追蹤結(jié)果顯示RGCs的存活數(shù)量增加，TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示RGCs

8、層的細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少;RITC標(biāo)記視神經(jīng)結(jié)果顯示存留和再生的軸突顯著增加，透射電鏡結(jié)果顯示大部分軸突的髓鞘板層保持緊致，少許稍有松散和變寬;瞳孔對(duì)光反射結(jié)果顯示瞳孔從最大縮小至最小時(shí)直徑的比值明顯減小，閃光視覺誘發(fā)電位結(jié)果顯示P波的潛伏期時(shí)間縮短、振幅增強(qiáng)。
　　(5)視網(wǎng)膜Nrn1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子表達(dá)的作用:Westernblot結(jié)果顯示同時(shí)上調(diào)pAkt1和pStat3表達(dá)，而對(duì)pAkt2和pErk1/2均

9、無明顯作用。視網(wǎng)膜Nrn1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞存活相關(guān)分子表達(dá)的作用:Western blot結(jié)果顯示視網(wǎng)膜中Bcl-2表達(dá)上調(diào)、Bax表達(dá)下調(diào)，Caspase3和Cleaved Caspase3表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　(1)玻璃體注射rAAV2-EGFP后，主要轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜中約70％的RGCs，幾乎不轉(zhuǎn)染RGCs層的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　(2)玻璃體注射rAAV2-Nrn1-EGFP后，Nrn1在視網(wǎng)膜內(nèi)過表達(dá)。