Neuritin慢病毒修復(fù)大鼠受損視神經(jīng)和RGC5的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 視神經(jīng)損傷是目前許多臨床眼部疾病和外傷治療的難點(diǎn)。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal Ganglion Cells，RGCs)的丟失及再生困難，是視神經(jīng)損傷導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮和失明的關(guān)鍵因素，如何進(jìn)行有效的逆轉(zhuǎn)治療一直是眼科和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域面臨的難題之一。Neuritin又名可塑性相關(guān)候選基因15(candidate plasticity-related gene15，CPG15)，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的新成員。Neuri

2、tin主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中，Neuritin是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)活動(dòng)發(fā)揮作用的共同下游因子，在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、促進(jìn)突觸成熟和調(diào)節(jié)突觸可塑性等方面均具有重要作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)基于Neuritin獨(dú)特的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用及其在神經(jīng)創(chuàng)傷、疾病中的變化和作用，研究視神經(jīng)損傷后Neuritin基因在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達(dá)變化，并以Neuritin為靶進(jìn)行治療，推測(cè)其對(duì)RGCs的存活和再生這一視神經(jīng)損傷和疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有明顯的

3、作用，將有助于進(jìn)一步揭示視神經(jīng)再生難的原因和探討視神經(jīng)修復(fù)的新方法。
　　 方法:
　　 (1)視神經(jīng)夾傷模型的制作:用Yasargil腦動(dòng)脈瘤夾于成年雄性大鼠視神經(jīng)眼球后約1 mm處夾傷9 s，模擬臨床造成視神經(jīng)不完全損傷。采用HE染色、CTB追蹤、透射電鏡觀察等方法觀察視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)的形態(tài)變化。
　　 (2)觀察Neuritin在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的時(shí)空表達(dá)變化:應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測(cè)Neu

4、ritin在組織細(xì)胞中的定位，再分別應(yīng)用Western blot和Real time PCR的方法檢測(cè)視神經(jīng)損傷后Neuritin在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化。
　　 (3)構(gòu)建Neuritin慢病毒質(zhì)粒并包裝測(cè)定其滴度。
　　 (4)體內(nèi)觀察Neuritin過(guò)表達(dá)對(duì)受損大鼠RGCs及視神經(jīng)的作用:大鼠視神經(jīng)夾傷前1周玻璃體注射Neuritin慢病毒，損傷2周后采用CTB順行標(biāo)記RGCs以觀察其存活及軸突的再生情況。<

5、br>　　 (5)體外觀察Neuritin蛋白或過(guò)表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系(Retinal GanglionCell-5，RGC5)的作用及機(jī)制:采用CCK8法或MTT法檢測(cè)Neuritin蛋白對(duì)受損RGC5存活的影響，相差顯微鏡拍照觀察Neuritin過(guò)表達(dá)對(duì)RGC5突起長(zhǎng)度的影響，DAPI染色和Western blot方法分別檢測(cè)Neuritin對(duì)RGC5細(xì)胞凋亡的影響:進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)信號(hào)通

6、路關(guān)鍵分子pSTAT3、pAKT和pERK的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)正常視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中Neuritin蛋白的表達(dá)定位:免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示在正常視網(wǎng)膜中Neuritin蛋白主要表達(dá)于RGCs胞體和突起及部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中;正常視神經(jīng)中Neuritin蛋白主要表達(dá)于RGCs軸突、少突膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中。
　　 (2)成功建立視神經(jīng)不完全損傷模型:HE染色結(jié)果顯示視神經(jīng)損傷后損傷區(qū)神經(jīng)外膜保持完整

7、，CTB追蹤結(jié)果顯示神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)側(cè)端仍保留有正常運(yùn)輸功能的軸突，透射電鏡結(jié)果顯示視交叉前段視神經(jīng)仍保留有正常樣軸突。
　　 (3)視神經(jīng)受損后Neuritin在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的時(shí)空表達(dá)變化規(guī)律:Westernblot顯示視神經(jīng)受損后1 d Neuritin蛋白在視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中表達(dá)升高，傷后3d、7d均高表達(dá)，其后緩慢下調(diào)至正常水平，Real time PCR的結(jié)果顯示傷后1 d NeuritinmRNA瞬時(shí)表達(dá)高表達(dá)，其后下

8、調(diào)至或低于正常水平。
　　 (4)成功構(gòu)建Neuritin慢病毒質(zhì)粒，并獲得高滴度的Neuritin慢病毒顆粒。
　　 (5)體內(nèi)Neuritin過(guò)表達(dá)對(duì)受損大鼠RGCs及視神經(jīng)的作用:損傷后2周Neuritin過(guò)表達(dá)組RGCs的存活明顯增加，存留及再生的軸突顯著增多。
　　 (6)體外Neuritin蛋白及過(guò)表達(dá)對(duì)RGC5的作用及機(jī)制:CCK8法結(jié)果顯示重組的人Neuritin蛋白可增加受損RGC5的存活，Ne

9、uritin過(guò)表達(dá)可增加RGC5最長(zhǎng)突起的長(zhǎng)度;DAPI染色及Caspase3表達(dá)的檢測(cè)顯示Neuritin過(guò)表達(dá)可以減少受損RGC5細(xì)胞的凋亡及活化型Caspase3的表達(dá)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)信號(hào)通路的檢測(cè)顯示Neuritin過(guò)表達(dá)可下調(diào)pSTAT3蛋白的表達(dá)，并上調(diào)pAKT和pERK蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 (1) Neuritin在正常視網(wǎng)膜中主要表達(dá)于RGCs及部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中，在視神經(jīng)中主要表達(dá)于RGC

10、s軸突、少突膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 (2)采用Yasagil腦動(dòng)脈瘤夾夾傷視神經(jīng)，可建立視神經(jīng)不完全損傷模型。
　　 (3)視神經(jīng)損傷早期視網(wǎng)膜及視神經(jīng)內(nèi)Neuritin的高表達(dá)，而后期Neuritin表達(dá)的不足提示可能為RGCs大量死亡和軸突再生失敗的原因之一。
　　 (4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)Neuritin過(guò)表達(dá)對(duì)視神經(jīng)損傷后的RGCs有保護(hù)作用，可以有效促進(jìn)RGCs的存活及其軸突的再生。