Nogo66蛋白眼用疫苗對(duì)大鼠高眼壓和視神經(jīng)損傷的免疫保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglial cells,RGCs)損傷后再生困難,這是青光眼、視神經(jīng)損傷等眼部疾病致盲的主要原因。目前認(rèn)為,RGCs受損后存活或再生困難的一個(gè)主要原因是由于髓磷脂蛋白的存在,抑制因子Nogo是其中重要成員之一。Nogo在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)有少量表達(dá),中樞神經(jīng)受損后Nogo因子釋放增加、表達(dá)增強(qiáng),不僅抑制神經(jīng)纖維再生,而且可啟動(dòng)神經(jīng)元凋亡過(guò)程,導(dǎo)

2、致神經(jīng)元死亡。Nogo有66個(gè)氨基酸殘基在胞膜外形成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),即Nogo66,是Nogo的活性區(qū)域,介導(dǎo)了Nogo的中樞神經(jīng)再生抑制活性。目前多項(xiàng)研究表明,用主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫阻遏髓磷脂或Nogo均可誘導(dǎo)CNS損傷動(dòng)物產(chǎn)生自身免疫保護(hù)反應(yīng),減少損傷后變性,促進(jìn)CNS神經(jīng)元再生。其機(jī)制尚不明確。
　　 在前期工作中,我們?cè)吮磉_(dá)純化了Nogo66蛋白,制備了Nogo66蛋白福氏佐劑疫苗,發(fā)現(xiàn)Nogo66蛋白疫苗可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生

3、較高滴度抗原特異性IgG抗體,刺激脾T淋巴細(xì)胞活化增殖,并可促進(jìn)慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)存活、損傷后的再生修復(fù),減少視神經(jīng)纖維進(jìn)一步損害、使神經(jīng)功能得到一定保護(hù)。證實(shí)了Nogo66蛋白疫苗具有免疫原性和視神經(jīng)損傷后的保護(hù)和修復(fù)作用。
　　 然而,青光眼和視神經(jīng)損傷是需要長(zhǎng)期治療的疾病,Nogo66蛋白疫苗接種后產(chǎn)生的免疫效應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短,需要不斷加強(qiáng)免疫才能維持一定的抗體滴度和活化T細(xì)胞數(shù)量,長(zhǎng)期高頻率地通過(guò)外

4、周皮下注射接種疫苗的方式顯然很難保證患者的依從性,治療效果可想而知;另外,Nogo66是一個(gè)分子量為7.53461kD的小分子蛋白,小劑量皮下接種很難激活機(jī)體免疫系統(tǒng),要獲得較好的免疫效應(yīng),需要增加劑量,則有致實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,必須改變接種途徑,減少疫苗中蛋白的使用劑量,減少接種頻率,使這種神經(jīng)免疫保護(hù)的治療方法得以實(shí)現(xiàn)。<

5、br>　　 眼瞼結(jié)膜血管分布密集,血液供應(yīng)非常豐富,有淺層和深層2個(gè)網(wǎng)狀淋巴系統(tǒng),在下眼瞼結(jié)膜皺褶中存在重要的局部淋巴組織,研究證實(shí)結(jié)膜的淋巴組織具有攝取粘膜表面多種抗原進(jìn)行識(shí)別,并作出反應(yīng)的功能,是一個(gè)理想的疫苗接種途徑。從上世紀(jì)60年代開(kāi)始,經(jīng)結(jié)膜接種疫苗途徑就已經(jīng)在家養(yǎng)動(dòng)物中廣泛應(yīng)用。
　　 殼聚糖(chitosan,CS)廣泛存在于自然界,具有無(wú)毒、良好的生物相容性、低免疫排斥反應(yīng)等一系列特殊的化學(xué)和生物特性。且其本身

6、具有免疫刺激活性,并可增強(qiáng)藥物滲透和吸收,是一種具有很大潛力的粘膜免疫緩釋材料和免疫佐劑。
　　 本課題在探討Nogo66蛋白疫苗對(duì)視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷的免疫保護(hù)作用機(jī)制的基礎(chǔ)上,改進(jìn)Nogo66蛋白疫苗的佐劑和接種途徑,制各一種滴眼液形式的Nogo66蛋白疫苗,并研究其理化性質(zhì)、免疫性質(zhì)和神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。
　　 主要研究?jī)?nèi)容包括以下7部分:
　　 1.不同濃度Nogo66蛋白疫苗對(duì)大鼠免疫系統(tǒng)的影響和大鼠免疫狀況

7、評(píng)估。在正常SD大鼠接種不同濃度的Nogo66蛋白疫苗,檢測(cè)接種后不同時(shí)間點(diǎn)血清IgG抗體滴度和脾T細(xì)胞增殖率,主要臟器病理檢查并進(jìn)行EAE狀態(tài)評(píng)價(jià)。
　　 2.Nogo66蛋白疫苗誘導(dǎo)大鼠機(jī)體產(chǎn)生的免疫效應(yīng)。以最佳疫苗接種劑量接種正常SD大鼠后,檢測(cè)大鼠血清IgG抗體滴度和脾分泌Th1類(lèi)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ,和Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4的情況。
　　 3.建立慢性高眼壓大鼠模型和視神經(jīng)鉗夾傷大鼠模型,通過(guò)檢測(cè)眼壓

8、、熒光金逆行染色視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù),和視網(wǎng)膜血管滲透率檢測(cè)對(duì)兩種視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷模型進(jìn)行鑒定。
　　 4.制備N(xiāo)ogo66蛋白眼用疫苗并進(jìn)行質(zhì)量控制。以殼聚糖為佐劑制備滴眼液形式的Nogo66蛋白疫苗,檢測(cè)其性狀、pH值、滲透壓、黏度值、含量和穩(wěn)定性。
　　 5.檢測(cè)Nogo66蛋白眼用疫苗的安全性。按照眼刺激性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行Nogo66-CS疫苗眼刺激性評(píng)分,HE染色法檢測(cè)Nogo66-CS疫苗對(duì)大鼠視網(wǎng)膜、心、腦、

9、睪丸等主要器官的病理?yè)p害,觀察Nogo66-CS疫苗的安全性。
　　 6.Nogo66蛋白眼用疫苗的免疫原性研究。體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞,免疫組化法Nogo66-CS疫苗對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b表達(dá)的影響;Nogo66-CS疫苗行正常大鼠結(jié)膜接種,檢測(cè)大鼠淚液及血清中IgG抗體滴度,檢測(cè)大鼠結(jié)膜組織抗原特異性IgG型漿細(xì)胞增生和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);免疫組化法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜CD11b、MHC-Ⅱ、INOS、TNF-α表達(dá),觀察:Nogo66蛋

10、白眼用疫苗免疫原性。
　　 7.探討Nogo66蛋白眼用疫苗對(duì)大鼠視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。給予慢性高眼壓模型大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠行結(jié)膜接種Nogo66蛋白眼用疫苗,0,21,35天各接種1次。49天時(shí)熒光金逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù),免疫熒光法、免疫組化法檢測(cè)視網(wǎng)膜GAP43、CD3、BDNF和GDNF表達(dá),免疫印記法檢測(cè)視網(wǎng)膜BDNF、GDNF表達(dá),探討Nogo66蛋白眼用疫苗對(duì)視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷免疫保

11、護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 主要結(jié)果及結(jié)論如下:
　　 1.接種不同濃度Nogo66蛋白疫苗后均可誘導(dǎo)大鼠血清IgG抗體滴度增高和T細(xì)胞增殖,其中200μg組IgG抗體滴度和T細(xì)胞增殖顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠未發(fā)現(xiàn)任何類(lèi)似實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的行為變化,且各器官病理檢查未見(jiàn)明顯異常。提示200μg/300μl可最佳程度誘導(dǎo)大鼠免疫反應(yīng)。
　　 2.Nogo66蛋白疫苗組大鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清I

12、L-2、IFN-γ、IL-4水平均增加,明顯高于對(duì)照組。其中Th1類(lèi)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ增高的幅度顯著大于Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4增高幅度。提示Nogo66疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)以Th1細(xì)胞免疫,即T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)為主。
　　 3.慢性高眼壓大鼠造模后第3天眼壓開(kāi)始升高,此后持續(xù)緩慢升高,1周時(shí)眼壓為(21.5±3.7)mmHg,與對(duì)照組存在顯著差異(P＜0.05)。第4周時(shí)達(dá)最高峰,為(24.8±3.2)mmHg;

13、到12周時(shí)眼壓未見(jiàn)明顯下降,與對(duì)照組眼壓仍存在顯著差異。熒光金逆行染色RGCs發(fā)現(xiàn),高眼壓后1m至3m時(shí)SD大鼠RGCs視網(wǎng)膜上RGCs密度持續(xù)降低、數(shù)量持續(xù)減少,與相同時(shí)間正常對(duì)照組比較均差異顯著;視神經(jīng)鉗央傷后1m時(shí)SD大鼠RGCs密度降低、數(shù)量顯著減少,與正常對(duì)照呈顯著性差異,3m時(shí)SD大鼠RGCs數(shù)量與1m時(shí)比較未見(jiàn)顯著差異。慢性高眼壓損傷后1、4、8周時(shí)熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜內(nèi)未見(jiàn)明顯伊文思藍(lán)滲透,視網(wǎng)膜滲透率較對(duì)照組無(wú)顯著差

14、異。視神經(jīng)鉗夾傷后1天視網(wǎng)膜內(nèi)可見(jiàn)明顯的藍(lán)色熒光,且逐漸減弱。視網(wǎng)膜通透性較對(duì)照組均增強(qiáng),存在顯著差異。提示本實(shí)驗(yàn)建立的慢性高眼壓和視神經(jīng)鉗央傷模型符合疾病特點(diǎn),RGCs呈特征性數(shù)量減少;慢性高眼壓尚不能破壞大鼠血視網(wǎng)膜屏障。視神經(jīng)鉗央傷早期即能引起血視網(wǎng)膜破壞,視網(wǎng)膜血管滲透性增強(qiáng),血視網(wǎng)膜屏障的這種損傷狀態(tài)可持續(xù)至少1個(gè)月。
　　 4.制備了Nogo66-CS眼用疫苗,經(jīng)檢測(cè),其性狀、pH值、滲透壓、黏度、含量及穩(wěn)定性均符合

15、滴眼液制劑的藥劑學(xué)要求,提示以殼聚糖為佐劑的Nogo66蛋白疫苗具有良好的理化性質(zhì)。
　　 5.眼刺激性試驗(yàn)顯示,點(diǎn)藥當(dāng)時(shí)和點(diǎn)藥后1h、24h、48h、72h、4d、7d,Nogo66-CS疫苗組和生理鹽水組大鼠眼刺激性反應(yīng)評(píng)分均＜3,裂隙燈下檢查眼前節(jié)無(wú)異常,且角膜熒光素鈉染色陰性,認(rèn)為Nogo66-CS眼用疫苗和生理鹽水對(duì)眼均無(wú)刺激性。于第一次點(diǎn)藥后第16周行眼球視網(wǎng)膜、心、肝、腎、肺、腦、睪丸病理檢查未見(jiàn)明顯異常。提示No

16、go66-CS疫苗無(wú)刺激性,對(duì)機(jī)體是安全的。
　　 6.Nogo66蛋白眼用疫苗具有免疫原性。體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞,在Nogo66-CS疫苗或Nogo66蛋白刺激后表達(dá)大量CD11b,細(xì)胞活化:CS刺激后表達(dá)少量CD11b,細(xì)胞靜止;空白組未見(jiàn)CD11b表達(dá)。結(jié)膜HE染色顯示Nogo66-CS組大鼠結(jié)膜組織內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸澗和IgG型陽(yáng)性漿細(xì)胞增生;Nog066組結(jié)膜組織可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和IgG型陽(yáng)性漿細(xì)胞;CS組結(jié)膜僅偶

17、見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),未見(jiàn)IgG型陽(yáng)性漿細(xì)胞存在。接種疫苗后,Nogo66-CS組淚液IgG抗體滴度從第20天開(kāi)始持續(xù)增高,與對(duì)照組有顯著差異,血清IgG抗體滴度第34天開(kāi)始增高,幅度較低;Nogo66組和CS組淚液和血清中IgG抗體滴度無(wú)顯著變化。Nogo66-CS組視網(wǎng)膜各層小膠質(zhì)細(xì)胞活化,表達(dá)CD11b和少量MHC-Ⅱ,未見(jiàn)明顯iNOS、TNF-α表達(dá);CS組視網(wǎng)膜僅少量CD11b表達(dá),未見(jiàn)iNOS、TNF-α表達(dá)。提示Nogo66-C

18、S疫苗可激活粘膜免疫和系統(tǒng)免疫,并誘導(dǎo)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化,具有較強(qiáng)的免疫原性。
　　 7.Nogo66蛋白眼用疫苗可促進(jìn)視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷后RGCs的存活和再生。慢性高眼壓模型大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠Nogo66-CS組RGCs數(shù)量顯著高于CS組和未接種組;Nogo66-CS組視網(wǎng)膜有大量GAP43,表明視網(wǎng)膜神經(jīng)元再生活躍。表明Nogo66蛋白眼用疫苗對(duì)受損的視網(wǎng)膜視神經(jīng)具有保護(hù)作用。
　　 8、Nogo66蛋白眼用