靶向HMGA2的慢病毒載體介導(dǎo)RNAi治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究.pdf

1、本文主要從以下三個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 HMGA2在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系
　　目的：
　　HMGA2是高遷移率蛋白家族非常獨(dú)特的成員，其基因在腫瘤中的表達(dá)增加與多種腫瘤細(xì)胞的增殖性和患者惡性預(yù)后關(guān)系密切。本研究目的是檢測(cè)HMGA2基因在正常腦組織和惡性膠質(zhì)瘤中的蛋白表達(dá)，并探討HMGA2與惡性膠質(zhì)瘤增殖性和侵襲性的相關(guān)性;HMGA2與MMP-2和MIB標(biāo)記系數(shù)(MIB-LI)之間的聯(lián)系以

2、及HMGA2與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的相關(guān)關(guān)系。
　　方法：
　　1.標(biāo)本
　　收集2010年10月-2013年5月期間山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科的原發(fā)惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本78例以及正常腦組織（取自腦內(nèi)血腫清除術(shù)患者）7例，其中女性41例（年齡21-78歲，平均年齡43.3±4.3歲），男性37例（年齡16-83歲，平均年齡44.5±3.5歲）。惡性膠質(zhì)瘤患者包括星形細(xì)胞瘤27例（WHOⅡ級(jí)），間變性星形細(xì)胞瘤25例（WHOⅢ級(jí)

3、），多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤26例（WHOⅣ級(jí)）。所有病例診斷均由術(shù)后的病理證實(shí)，并得到山東省立醫(yī)院病理科的診斷。所有患者術(shù)前均未接受手術(shù)或者放化療，星形細(xì)胞瘤患者術(shù)后未行放化療，間變性星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者術(shù)后均接受放化療。手術(shù)標(biāo)本部分保存于4％多聚甲醛，部分于-80℃保存以提取mRNA和蛋白質(zhì)。
　　2.免疫組織化學(xué)染色方法
　　采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接(S-P)法，在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程下操作，檢測(cè)H

4、MGA2、MMP-2和Ki-67蛋白在正常腦組織和不同WHO分級(jí)惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，以及他們之間的相關(guān)性。
　　3.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
　　根據(jù)半定量免疫組織化學(xué)法評(píng)價(jià)HMGA2反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞顯色比例和強(qiáng)度。在光學(xué)顯微鏡高倍視野(×400)下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)每200個(gè)腫瘤細(xì)胞中免疫反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞所占百分比。每張病理切片分別有4名實(shí)驗(yàn)者在雙盲的前提下單獨(dú)進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于有分歧的結(jié)果，由實(shí)驗(yàn)者在雙頭顯微鏡下重復(fù)評(píng)價(jià)

5、，直至達(dá)到一致。
　　HMGA2表達(dá)評(píng)估:強(qiáng)陽(yáng)性(+++):陽(yáng)性細(xì)胞比例大于65％或顯色深（深棕褐色）;中度陽(yáng)性(++):陽(yáng)性細(xì)胞比例介于30％至65％之間或染色略深（黃褐色）;弱陽(yáng)性(+):陽(yáng)性細(xì)胞比例小于30％或顯色淺（淺黃色）;陰性（-）:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞染色。
　　4.測(cè)定HMGA2、MMP-2和Ki-67 mRNA水平和蛋白表達(dá)量
　　提取組織中總mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)法檢測(cè)7

6、例正常腦組織和29例惡性膠質(zhì)瘤組織中HMGA2、MMP-2和Ki67等目的基因的mRNA表達(dá)情況。提取組織中總蛋白，使用Western blot法檢測(cè)HMGA2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　HMGA2在正常腦組織中無(wú)表達(dá)，在惡性膠質(zhì)瘤中可見(jiàn)強(qiáng)弱不等的細(xì)胞核著色。HMGA2在膠質(zhì)瘤組織中總的陽(yáng)性（率）為92.3％(72/78)。HMGA2與膠質(zhì)瘤惡性程度存在顯著性差別:在間變性星形細(xì)胞瘤(P=.037)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中(P=.0

7、07)的表達(dá)高于星形細(xì)胞瘤，然而在間變性星形細(xì)胞瘤與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤間未發(fā)現(xiàn)明顯差別(P=.862)。HMGA2的表達(dá)與Ki-67(r=0.415，P＜.01)和MMP-2(r=0.363，P＜.01)存在相關(guān)性，但是未發(fā)現(xiàn)其與患者年齡(r=-0.073，P=.525)和性別(r=0.415，P＜.01)存在相關(guān)關(guān)系。另外，qRT-PCR結(jié)果顯示HMGA2 mRNA在間變性星形細(xì)胞瘤（1.98倍，P=.029）和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(2.56倍，P

8、＜.01)中的表達(dá)高于星形細(xì)胞瘤，然而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與間變性星形細(xì)胞瘤間未發(fā)現(xiàn)明顯差別（1.29倍，P=.118）。
　　結(jié)論：
　　1.HMGA2在正常腦組織中幾乎無(wú)表達(dá)。
　　2.HMGA2在不同WHO病理級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有顯著性差異，HMGA2的表達(dá)與WHO分級(jí)相關(guān)，同時(shí)HMGA2與MMP-2和Ki-67的表達(dá)間的相關(guān)性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HMGA2與膠質(zhì)瘤增殖性和侵襲性存在相關(guān)關(guān)系，HMGA2免疫組織化學(xué)

9、染色有助于不同惡性膠質(zhì)瘤的診斷。
　　3.在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，HMGA2高表達(dá)組患者的生存預(yù)后差于低表達(dá)組，提示HMGA2表達(dá)可以作為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的有效臨床預(yù)后指標(biāo)。
　　第二部分 設(shè)計(jì)合成并篩選針對(duì)HMGA2有效的ShRNA慢病毒載體
　　目的：
　　設(shè)計(jì)并合成3組靶向HMGA2基因的ShRNA載體，進(jìn)行慢病毒包裝和提取，并驗(yàn)證干擾效率，篩選出其中2組有效的慢病毒載體，為下一步的研究做準(zhǔn)備。

10、　　方法：
　　1.設(shè)計(jì)合成ShRNA載體并進(jìn)行慢病毒包裝
　　運(yùn)用公眾網(wǎng)站設(shè)計(jì)軟件，靶向人類(lèi)HMGA2靶基因序列，設(shè)計(jì)3組ShRNA載體，并驗(yàn)證其特異性，分別編號(hào)為1＃，2＃，3＃;1組陰性對(duì)照空白載體，編號(hào)為0＃。然后進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。結(jié)果顯示四組載體均被構(gòu)建成功，測(cè)序結(jié)果證實(shí)無(wú)誤。應(yīng)用工具細(xì)胞株（人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞株HEK293T）進(jìn)行慢病毒包裝并離心提取包裝成功的慢病毒顆粒，然后進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。
　　2.嘌呤霉素篩選

11、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株
　　將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/ml，在0.2μg/ml-5μ g/ml的嘌呤霉素濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10-14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度(1μ g/ml)來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后開(kāi)始加嘌呤霉素(1μ g/ml)進(jìn)行篩選。隨著細(xì)胞代謝，嘌呤霉素的濃度和活性會(huì)逐漸下降，因此每3-5天更換一次含嘌呤霉素的篩選液。熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，14天后，即可篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的

12、細(xì)胞株，并后續(xù)置于含嘌呤霉素0.2μg/ml的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。4.驗(yàn)證沉默目的基因效果，篩選有效慢病毒載體。
　　結(jié)果：
　　1.在3組實(shí)驗(yàn)組shRNA載體中，1＃、2＃、3＃轉(zhuǎn)染效率分別為89.4±6.5％、93.6±5.7％、78.6±12.3％;陰性對(duì)照空白載體0＃的轉(zhuǎn)染效率為96.1±5.4％。2.3個(gè)靶點(diǎn)均對(duì)HMGA2有沉默效果。與陰性對(duì)照載體0＃對(duì)比，實(shí)驗(yàn)載體1＃，2＃，3＃沉默效率分別為78.3％、82.4％

13、、50.6％。綜合轉(zhuǎn)染效率與沉默效果，1＃、2＃載體為理想靶點(diǎn)，我們?cè)谄渲羞x取了載體1＃進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)論：
　　1.本部分實(shí)驗(yàn)成功設(shè)計(jì)并構(gòu)建了3組特異性靶向人類(lèi)HMGA2基因的ShRNA慢病毒載體，病毒滴度較高，可以滿(mǎn)足下一步的實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.從3組重組載體中，根據(jù)靶向基因的mRNA和蛋白質(zhì)沉默效率，篩選出2組靶向HMGA2的高效率慢病毒載體，為下一步靶向人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株的HMGA2基因進(jìn)行轉(zhuǎn)

14、染沉默提供了可靠有效的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分 慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默HMGA2基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響
　　目的：
　　利用構(gòu)建好的高度特異性和轉(zhuǎn)染率的攜帶靶向HMGA2 ShRNA的慢病毒載體1＃轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，并通過(guò)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，研究它們介導(dǎo)RNA干擾對(duì)人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251增殖和侵襲的影響及其意義。
　　方法：
　　1.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖水

15、平
　　培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（U251細(xì)胞）。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組（空白對(duì)照，陰性對(duì)照以及陽(yáng)性）情況，將細(xì)胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。第2天后每24小時(shí)進(jìn)行一次CCK-8分析，檢測(cè)對(duì)RNAi靶點(diǎn)有效干擾后的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖水平變化。
　　2.小室結(jié)合基底膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U251細(xì)胞的細(xì)胞侵襲
　　培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（U251細(xì)胞）。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組（空白對(duì)照，陰性對(duì)照以及陽(yáng)性）

16、情況，進(jìn)行鋪matrigel膠的小室實(shí)驗(yàn)分析，檢測(cè)對(duì)RNAi靶點(diǎn)有效干擾后的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組慢病毒載體1＃的增殖抑制率(IR)分別為45.2％和40.3％，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，這一結(jié)果提示在HMGA2被沉默后，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能力明顯被抑制。
　　2.通過(guò)小室侵襲方法檢

17、測(cè)U251細(xì)胞侵襲性，結(jié)果顯示兩個(gè)慢病毒載體組與對(duì)照組比較，在沉默HMGA2基因后，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞群體中，侵襲能力明顯降低(P＜0.05)。
　　3.通過(guò)小室遷移方法檢測(cè)U251細(xì)胞侵襲性，結(jié)果顯示兩個(gè)慢病毒載體組與對(duì)照組比較，在沉默HMGA2基因后，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞群體中，遷移能力明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.HMGA2基因?qū)τ谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力具有重要作用;特異性沉默HMGA2基因

18、能引起人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期遲緩。
　　2.HMGA2基因?qū)τ谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性同樣具有重要作用;特異性沉默HMGA2基因能有效降低人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251的侵襲能力和遷移能力。
　　3.Jnk和p38MAPK信號(hào)通路可能是HMGA2侵襲性和增殖性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。
　　4.RNA干擾技術(shù)在未來(lái)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療的研究方面具有非常光明的應(yīng)用價(jià)值。HMGA2基因能夠作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療的有效靶