RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)ABP-5基因?qū)θ烁伟〩epG2細(xì)胞和裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的：探討RNA干擾(RNA interference)介導(dǎo)表皮脂肪酸結(jié)合蛋白(fattyacid binding protein-5，F(xiàn)ABP-5)基因沉默的重組慢病毒載體(LV-shRNA-FABP5)對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的細(xì)胞增殖和基因表達(dá)、細(xì)胞周期和凋亡變化情況、細(xì)胞侵襲能力改變和裸鼠成瘤情況的影響。
　　方法：1.RT-PCR方法分別檢測(cè)在人肝癌細(xì)胞系HepG2、SK-HEP-1和SMMC-7721細(xì)胞中FABP-5

2、 mRNA的表達(dá)量，篩選目的細(xì)胞。
　　2.RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)合成3個(gè)特異性靶向FABP-5基因的shRNA重組慢病毒載體(FABP5-shRNA表達(dá)載體)，轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細(xì)胞，對(duì)不同靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。
　　3.實(shí)驗(yàn)分為三組。FABP-5基因沉默重組慢病毒顆粒(LV-shRNA-FABP5)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(Knock Down，KD);空載體重組慢病毒顆粒(LV-shRNA-NC)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞作為陰性

3、對(duì)照組(Negative Control，NC);空白對(duì)照組(Control)為正常條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。采用RT-PCR及免疫蛋白印記法檢測(cè)FABP-5 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　4.MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;Giemsa染色法觀察各組細(xì)胞的克隆形成情況;細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡情況。
　　5.將實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的細(xì)胞分別接種于裸鼠右腋皮下0.5cm處，構(gòu)建

4、裸鼠肝癌移植瘤模型。連續(xù)4周觀察裸鼠的成瘤情況、移植瘤大小及體積變化，繪制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線。采用小動(dòng)物活體成像儀觀察裸鼠肝癌移植瘤的生長(zhǎng)狀況。4周后處死裸鼠，稱量移植瘤的重量及計(jì)算瘤體體積。RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法測(cè)定腫瘤組織中FABP-5基因的mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：1.RT-PCR結(jié)果提示FABP5在SMMC-7721中的表達(dá)豐度做敲減實(shí)驗(yàn)存在風(fēng)險(xiǎn)，在HepG2、SK-HEP-1

5、中的表達(dá)豐度滿足敲減實(shí)驗(yàn)要求。而HepG2細(xì)胞中表達(dá)豐度最高，篩選出人肝癌細(xì)胞HepG2作為目的細(xì)胞。
　　2.成功構(gòu)建了FABP5基因沉默的慢病毒載體。轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細(xì)胞中，觀察得到轉(zhuǎn)染效率均＞90％以上。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示:三個(gè)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，F(xiàn)ABP-5 mRNA的表達(dá)量減少均＞50％以上，其中LV-shRNA-FABP5(1)組(即1號(hào)靶點(diǎn))FABP-5表達(dá)的敲減率最高，達(dá)85

6、％以上(P＜0.05)。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于陰性對(duì)照組，LV-shRNA-FABP5(1)靶點(diǎn)的FABP-5蛋白表達(dá)減少88.28％(P＜0.05)，將此組作為實(shí)驗(yàn)組。
　　4.MTT法結(jié)果得到A490值分別在第1、2、3、4和5d時(shí)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均明顯高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。Giemsa染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的克隆形成數(shù)(12±2)明顯低于空白對(duì)照組(149±10)及陰性對(duì)照組(146±11)，實(shí)驗(yàn)

7、組細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制（P＜0.05）。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)得出，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移率（0.87％±0.11％）相比空白對(duì)照組（3.45％±0.12％）和陰性對(duì)照組（3.37％±0.06％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果:相比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組G1期比例降低，S期和G2/M期比例增高（P均＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組中HepG2細(xì)胞凋亡率（26.88％±0.11％）明顯高于陰性對(duì)照組（2.13％±0.36％）

8、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.裸鼠接種肝癌HepG2細(xì)胞后，三組裸鼠右腋下均有肉眼可見的腫瘤長(zhǎng)出，成瘤率100％，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組移植瘤的生長(zhǎng)及成瘤能力明顯減慢(P＜0.05)。4周后測(cè)量空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織平均體積分別為:(100.51±47.45)mm3、(104.02±52.89)mm3、(29.41±8.98)mm3(P＜0.05);空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的瘤體平均重量分別為:(

9、0.632±0.203)g、(0.629±0.226)g、(0.204±0.067)g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RT-PCR、Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)FABP-5在實(shí)驗(yàn)組中mRNA和蛋白表達(dá)量低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)提示FABP-5蛋白表達(dá)情況基本和Western blot結(jié)果相符，在裸鼠肝癌移植瘤組織中表達(dá)FABP-5陽(yáng)性信號(hào)定位于在細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿中表達(dá)，相

10、比于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組FABP-5陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.FABP-5基因的RNAi重組體可以有效抑制FABP-5基因的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　2.人肝癌HepG2細(xì)胞中FABP-5基因沉默后細(xì)胞增殖受到抑制，癌細(xì)胞侵襲力降低，細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。
　　3.RNA干擾技術(shù)沉默HepG2細(xì)胞中FABP-5基因可以明顯抑制人肝癌裸鼠