人端粒酶催化亞單位啟動子調(diào)控自殺基因HSV-TK靶向性表達(dá)治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的 自殺基因治療是一種重要的腫瘤基因治療策略，也是腫瘤研究的熱點(diǎn)課題之一。HSV-TK／GCV是最具代表性的自殺基因系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)室研究和臨床試驗(yàn)結(jié)果均顯示了廣闊的應(yīng)用前景。然而，與其他許多基因治療方案面臨的問題相似，由手治療作用缺乏腫瘤靶向性，HSV-TK／GCV對正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能也有一定程度的損傷作用?，F(xiàn)有的臨床試驗(yàn)顯示，HSV-TK／GCV治療方案的副作用多，盡管大多數(shù)比較輕；而且有動物實(shí)驗(yàn)顯示，HSV-TK／

2、GCV治療系統(tǒng)有導(dǎo)致嚴(yán)重肝損害的可能。因此，HSV-TK／GCV治療方案的臨床應(yīng)用，仍存在不容忽視的潛在風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤基因治療的理想結(jié)果是，目的基因表達(dá)對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生盡可能強(qiáng)的殺傷作用，同時又避免對正常細(xì)胞的毒性反應(yīng)。靶向性基因治療可能是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有效途徑，也是腫瘤研究中被人們寄以厚望的方法之一。靶向性基因治療可以通過目的基因靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶向性表達(dá)兩個環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)。近年來，對基因結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)節(jié) 機(jī)制認(rèn)識的不斷完善，以及以核酸分子克

3、隆為核心的分子生物學(xué)理論、技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的研究者認(rèn)為，通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控目的基因特異性表達(dá)，來實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性基因治療具有更強(qiáng)的可行性和更高的可靠性。組織或腫瘤特異性的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是實(shí)現(xiàn)基因靶向性表達(dá)的必要條件，它在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用使治療基因在特定的組織、器官或腫瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)，避免或減輕治療基因表達(dá)對正常細(xì)胞的不良作用。前列腺特異性抗原(PSA)、甲胎球蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)啟動子是以往腫瘤靶向性基因治療研究中

4、應(yīng)用最多的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，大量研究證實(shí)了這種靶向性基因治療策略的可行性。然而，上述啟動子作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件存在轉(zhuǎn)錄活性弱，應(yīng)用范圍窄等諸多局限性，無法滿足腫瘤靶向性基因治療的要求。尋找轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)、腫瘤特異性高和適用范圍廣的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，對腫瘤靶向性基因治療具有重要意義。端粒酶是一種廣譜的腫瘤標(biāo)志物，其功能是合成染色體末端的端粒DNA序列，維持染色體結(jié)構(gòu)的完整和細(xì)胞的持續(xù)增殖能力。85％以上的腫瘤細(xì)胞具有端粒酶活性，而絕大多數(shù)正常

5、體細(xì)胞無端粒酶活性。 端粒酶催化亞單位(hTERT)是端粒酶的重要組成部分，它是一種以RNA為轉(zhuǎn)錄模板的逆轉(zhuǎn)錄酶。hTERT基因的表達(dá)水平是端粒酶活性的決定性因素，近年來的研究表明，hTERT啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，是hTERT基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，hTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性應(yīng)該具有高度的腫瘤特異性，有可能是腫瘤靶向性基因治療中理想的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。近年來，國內(nèi)外的研究均取得了一些較好的結(jié)果。本研究的目的是探索應(yīng)用h

6、TERT啟動子調(diào)控自殺基因HSV-TK／GCV系統(tǒng)靶向性治療肺癌的可能性和方法。 材料與方法 (1)以人胚腎細(xì)胞HEK 293基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR方法，克隆具有轉(zhuǎn)錄活性的hTERT啟動子核心片段，并插入含熒光素酶基因的報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Basic中，構(gòu)建hTERT啟動子調(diào)控的熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒pGL3-hTp，應(yīng)用脂質(zhì)體法將pGL3-hTp轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞株A549、A2、LTEPα-2、YTMLC-9、SPC-

7、A-1、NCI-H446、GLC-82、NCI-H460和端粒酶陰性的人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5，檢測hTERT啟動子在上述肺癌細(xì)胞株和MRC-5細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)錄活性； (2)將自殺基因HSV-TK)A分別插入質(zhì)粒pGL3-hTp和pGL3-Control中，取代熒光素酶基因，分別構(gòu)建hTERT啟動子和Sv40啟動子調(diào)控的TK基因表達(dá)質(zhì)粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK，并用PCR和酶切方法進(jìn)行鑒定； (

8、3)應(yīng)用脂質(zhì)體法分別將pGL3-hTp-TK、pGL3-SV40-TK(陽性對照)和空載體pGL3-hTp(陰性對照)轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞株A549和人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別命名為A549／SV40-TK、A549／hTD-TK、A549／hTp、 MRC／SV40-TK、MRC／hTp-TK和MRC／hTp，用PCR和RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中TK基因的存在狀態(tài)和表達(dá)水平；用MTT法檢測GCv對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株

9、體外增殖的抑制作用，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測GCV對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的凋亡和細(xì)胞周期的影響； (4)將人肺腺癌細(xì)胞A549接種于裸鼠皮下，然后用質(zhì)粒-脂質(zhì)體瘤內(nèi)注射和GCV腹腔注射方法，研究hTERT啟動子調(diào)控HsV-TK/GCV對裸鼠A549移植瘤的生長抑制作用。 結(jié)果 (1)成功克隆出hTERT啟動子核心片段，長1083 bp，DNA測序結(jié)果與GeneBank中hTERT啟動子的堿基序列完全一致；hTERT啟動子在各

10、種肺癌細(xì)胞株中均有轉(zhuǎn)錄活性(8.7％～54.4％，以含SV40啟動子和增強(qiáng)子的pGL3-Control質(zhì)粒為陽性對照)，在MRC-5細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性僅為6.7％： (2)pGL3-hrp-TK和pGL3-SV40-TK重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，應(yīng)用酶切和PCR方法鑒定，結(jié)果均與理論值相符；(3)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株A549／SV40-TK和A549／hTp-TK均有TK mRNA表達(dá)，GCV對其體外增殖具有明顯抑制作用；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株MRC／SV4

11、0-TK有TK mRNA表達(dá)，GCV對其增殖具有明顯抑制作用，MRC／hTp-TK無TK mRNA表達(dá)，GCV對其增殖無明顯抑制作；GCV處理后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株A549／SV40-TK和A549／hTp-TK細(xì)胞凋亡指數(shù)(分別為23.19％和21.58％)均顯著高于A549／hTp(0.78％)和空白對照(2.17％)；GCV處理后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株MRC／SV40-TK細(xì)胞凋亡指數(shù)(9.35％)顯著升高，而MRC／hTp-TlK細(xì)胞凋亡指數(shù)

12、(0.88％)與空白對照(0.60％)和MRC／hTp(0.55％)無顯著性差異；4)SV40啟動子和hTERT啟動子調(diào)控的HSV-TK／GCV系統(tǒng)對裸鼠A549移植瘤的生長均具有明顯抑制作用，抑瘤率分別為47％和40％，均顯著高于各陰性對照組(分別為10％，14％，7％和8％)。 結(jié)論(1)hTERT啟動子在各種肺癌細(xì)胞株中有高低不同的轉(zhuǎn)錄活性，在正常細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性極低；(2)hTERT啟動子作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以實(shí)現(xiàn)自殺