抗原致敏DC聯(lián)合CIK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞殺傷作用的研究.pdf

1、腫瘤患者的外周血中存在癌細(xì)胞是引發(fā)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、導(dǎo)致患者死亡的重要原因.有效清除血循環(huán)中的微量癌細(xì)胞對(duì)預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、改善腫瘤晚期患者的生存質(zhì)量具有重要意義.而體內(nèi)回輸免疫活性細(xì)胞的過(guò)繼免疫療法可以在不損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下,直接殺傷腫瘤細(xì)胞,已成為腫瘤手術(shù)、放療、化療的重要輔助治療方法. 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer,CIK)是由IFN-r、CD3單抗及IL-2等細(xì)胞因子在體外刺激外

2、周血單個(gè)核細(xì)胞而誘生出的具有非特異性細(xì)胞毒作用的效應(yīng)細(xì)胞.在現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的所有免疫效應(yīng)細(xì)胞中,具有較強(qiáng)的增殖能力、較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和非MHC限制性.而樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞,可有效激發(fā)免疫應(yīng)答.因此將CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用治療惡性腫瘤,無(wú)疑會(huì)起到協(xié)同作用.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抗原致敏DC聯(lián)合CIK對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和肺腺癌原代細(xì)胞的殺傷作用研究提供理論及試驗(yàn)依據(jù).目的研究腫瘤抗原致敏

3、的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和肺腺癌原代細(xì)胞的殺傷作用,并與DC聯(lián)合淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lyInphokine-activated killer,LAK)、CIK、LAK的殺傷效果進(jìn)行比較.為臨床DC聯(lián)合CIK治療肺癌提供理論和試驗(yàn)依據(jù). 方法 在無(wú)菌條件下取健康獻(xiàn)血者外周新鮮血,采用Ficoll密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC),常規(guī)誘導(dǎo)出.DC、CIK、L

4、AK細(xì)胞:用肺癌A549細(xì)胞提取的腫瘤抗原沖擊DC,倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC經(jīng)抗原沖擊和未經(jīng)腫瘤抗原沖擊后其表型變化;把CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、LAK細(xì)胞和.DC-LAK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,肺癌細(xì)胞株A549和肺腺癌原代細(xì)胞作為靶細(xì)胞,共分為8組,在10:1、20:1、50:11的效靶比時(shí),進(jìn)行殺傷試驗(yàn);使用LDH釋放法測(cè)定殺傷活性;ELISA法檢測(cè)殺傷試驗(yàn)中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-12、IFN-r的分

5、泌水平. 結(jié)果 一、細(xì)胞形態(tài)與增殖觀察:從外周血分離出單個(gè)核細(xì)胞,貼壁培養(yǎng)2小時(shí),貼壁的細(xì)胞用于誘導(dǎo)生成DC,培養(yǎng)8天倒置顯微鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞變大、不規(guī)則,伸出偽足,而用肺癌腫瘤抗原沖擊后24h大部分細(xì)胞出現(xiàn)毛刺狀突起呈典型樹(shù)突狀細(xì)胞.懸浮的細(xì)胞分別用于誘導(dǎo)生成CIK和LAK細(xì)胞,3天后CIK細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,出現(xiàn)大量的生長(zhǎng)集落,體積明顯變大呈多形性.而L,AK細(xì)胞形態(tài)單一,無(wú)明顯集落形成.CIK細(xì)胞的增殖能力明顯高于同條件

6、下培養(yǎng)的LAK細(xì)胞. 二、DC表型分析:流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC經(jīng)腫瘤抗原沖擊和未經(jīng)腫瘤抗原沖擊其表面分子表達(dá)情況,未經(jīng)腫瘤抗原沖擊的DC其表面分子CD40、CD80、CD86、 HLA.DR表達(dá)分別為:4.25﹪、12.12﹪、5.16﹪、38.02﹪;經(jīng)腫瘤抗原沖擊后的DC其表面分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR表達(dá)分別為74.31﹪、85.81﹪、53.29﹪、90.71﹪,差異顯著(P<0.01),這說(shuō)明經(jīng)腫瘤抗原

7、沖擊后DC細(xì)胞明顯成熟. 三、細(xì)胞殺傷試驗(yàn):在10:1、20:1、50:1三種效靶比時(shí),用LDH釋放法測(cè)定DC-CIK細(xì)胞、DC-LAK細(xì)胞和CIK、LAK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和肺腺癌原代細(xì)胞的殺傷活性.結(jié)果顯示:1、在同一效靶比時(shí),DC-CIK細(xì)胞組對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng),明顯高于CIK、DC-LAK、LAK細(xì)胞組(P<0.05).2、在效靶比例為10:1～50:1的范圍內(nèi),DC.CIK細(xì)胞組殺傷活性隨著效靶比提高而明顯升

8、高,以效靶比為50:1時(shí),殺傷活性最強(qiáng)(P<0.05).3、在同一效靶比時(shí),DC-CIK細(xì)胞組對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和肺腺癌原代細(xì)胞的殺傷作用無(wú)明顯差異(P>0.05). 四、細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中細(xì)胞因子分泌水平:在效靶比為50:1時(shí),檢測(cè)8組細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-12、IFN-r量的變化.在同一靶細(xì)胞條件下,DC-CIK細(xì)胞組中IFN-r、IL-12的含量明顯高于其它3組(P<0.05);而IL-2的含量以D

9、C-LAK細(xì)胞組為最高,DC-LAK和LAK細(xì)胞組明顯高于其他2組(P<0.05);在8組細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中,都沒(méi)有檢測(cè)到IL-4. 結(jié)論 肺癌抗原致敏的DC聯(lián)合CIK細(xì)胞能顯著提高對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用.DC.CIK細(xì)胞對(duì)肺癌的殺傷作用明顯高于CIK、DC-LAK、LAK細(xì)胞.這可能由于腫瘤抗原致敏的DC通過(guò)分泌一些細(xì)胞因子和共刺激分子來(lái)誘導(dǎo)特異性CIK細(xì)胞及促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖,通過(guò)這兩方面來(lái)顯著提高CIK細(xì)胞的殺瘤效應(yīng).D