DC-CIK細胞聯(lián)合sorafenib對肺腺癌細胞的殺傷效應(yīng)及其機制的研究.pdf

1、目的：肺癌的發(fā)病率和死亡率在我國和全球范圍內(nèi)高居首位，是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。近年來，肺癌治療領(lǐng)域雖然取得了長足的進步，但治療總體療效未有突破性進展，晚期肺癌的5年生存率不超過20％。這迫使我們不得不探尋新的治療模式來進一步提高抗腫瘤療效并減輕毒副反應(yīng)。分子靶向治療和過繼免疫療法以特異性強和安全性高的特點備受免疫治療領(lǐng)域中研究者的關(guān)注。為特異性地增強抗腫瘤療效，減少治療相關(guān)的不良反應(yīng)，克服腫瘤細胞的耐藥性，本研究通過比較肺腺癌

2、細胞A549（KRAS基因突變型/EGFR基因野生型）和PC9（EGFR基因突變型/KRAS基因野生型）對Sorafenib的敏感性，以及觀察DC-CIK聯(lián)合Sorafenib的抗瘤效應(yīng)，初步探討其作用機制，為臨床上EGFR-TKI原發(fā)耐藥（KRAS基因突變型）的NSCLC患者進行DC-CIK聯(lián)合Sorafenib治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用熒光定量PCR法鑒定肺腺癌細胞系A(chǔ)549和PC9的KRAS和EGF

3、R基因突變狀態(tài)。
　?。?）從肺癌患者PBMC中體外常規(guī)誘導(dǎo)DC與CIK，一周后共培養(yǎng)，收集第7天DC-CIK，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)，流式細胞術(shù)分析其免疫表型和活化性受體（NKG2D）。
　　（3）MTT法檢測Sorafenib對腫瘤細胞的增殖抑制作用。
　　（4）CCK-8法檢測Sorafenib對DC-CIK增殖的影響。
　　（5）CCK-8法檢測不同效靶比的DC-CIK細胞聯(lián)合Sorafenib對肺腺癌

4、細胞系的殺傷作用。
　?。?）RTCA動態(tài)監(jiān)測不同效靶比的DC-CIK細胞聯(lián)合Sorafenib作用下的肺腺癌細胞系的增殖情況。
　?。?）Annexin-V/PI雙染法檢測DC-CIK細胞聯(lián)合Sorafenib作用下的肺腺癌細胞系的凋亡率。
　?。?）實時熒光定量PCR及流式細胞術(shù)分別檢測Sorafenib作用24 h后NKG2D配體的mRNA和蛋白表達。
　　結(jié)果：
　?。?）本研究所選用的A549細胞

5、屬于KRAS基因突變型/EGFR基因野生型；而PC9細胞屬于EGFR基因突變型/KRAS基因野生型，符合文獻報道的結(jié)果。
　?。?）本研究體外培養(yǎng)獲得的第7天DC細胞表面CD83、CD86、CD11c及HLA-DR的表達率較培養(yǎng)第1天顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DC-CIK共培養(yǎng)7天后，CD3+CD56+細胞達（50.27±1.11）%，NKG2D+表達率為（53.49±2.09）%。
　?。?）Soraf

6、enib對A549和PC9細胞均有增殖抑制作用，此抑制作用呈劑量和時間依賴性；Sorafenib作用于A549和PC9細胞的24 h和48 h的IC50無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）,提示此增殖抑制作用與細胞的KRAS基因和EGFR基因所處狀態(tài)無相關(guān)性。
　?。?）聯(lián)合療法組中的殺傷率明顯高于單獨療法，標(biāo)準(zhǔn)化細胞指數(shù)（CI）明顯低于單獨療法組，提示DC-CIK細胞與Sorafenib對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)具有協(xié)同作用，且殺傷率隨效靶比

7、增加而提高；抗NKG2D抗體封閉可以減弱DC-CIK的殺傷作用（P<0.05）。5μmol/L Sorafenib對DC-CIK的增殖無統(tǒng)計學(xué)影響（P>0.05）。
　?。?）聯(lián)合療法組中的總凋亡率顯著高于單獨療法組，提示DC-CIK細胞聯(lián)合Sorafenib對腫瘤細胞的協(xié)同抗瘤效應(yīng)部分是通過凋亡誘導(dǎo)實現(xiàn)的。
　　（6）5μmol/L Sorafenib作用24 h后，腫瘤細胞NKG2D配體（ULBP1、UBLP2、ULBP

8、3）的mRNA和蛋白的表達量均有不同程度上調(diào)，A549和PC9細胞中上調(diào)的NKG2D配體種類和程度有差別，提示DC-CIK細胞聯(lián)合Sorafenib對腫瘤細胞的協(xié)同抗瘤效應(yīng)部分是通過調(diào)節(jié)NKG2D-NKG2DLs通路實現(xiàn)的。
　　結(jié)論： Sorafenib對肺腺癌細胞A549和PC9細胞均有增殖抑制作用，與腫瘤細胞的KRAS基因和EGFR基因所處狀態(tài)無相關(guān)性；DC-CIK細胞聯(lián)合Sorafenib對腫瘤細胞的抗瘤效應(yīng)具有協(xié)同作用，