表達(dá)綠色熒光蛋白的重組人偏肺病毒的構(gòu)建及其致病性的研究.pdf

1、人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)屬于副粘病毒科偏肺病毒屬，是偏肺病毒屬中唯一能感染人類的單股負(fù)鏈不分節(jié)段 RNA病毒?，F(xiàn)有流行病學(xué)資料顯示，HMPV呈全球流行，為兒科較為常見的呼吸道病原。臨床癥狀與肺病毒屬的呼吸道合胞病毒(RSV)感染相似，出現(xiàn)嚴(yán)重的咳嗽，氣管炎和肺炎，經(jīng)常伴有高熱，肌痛和嘔吐，并導(dǎo)致免疫功能不全者死亡。
　　HMPV主要有A、B兩型，分別以加拿大分離株 CAN97-83(NL/

2、1/00)及CAN98-75(NL/1/99)為代表，每型內(nèi)又可分為兩個不同的亞型。
　　本研究采用反向遺傳學(xué)技術(shù)，在HMPV NL/1/99(B型)代表株基因組內(nèi)插入表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光的外源基因，成功救獲了重組病毒rHMPV NL/1/99-EGFP。通過熒光共聚焦、電鏡觀察及生長動力學(xué)研究，證實(shí)最終拯救出具有感染性的rHMPV NL/1/99-EGFP重組病毒顆粒且救獲病毒保持野生型HMPV的特點(diǎn)。采用改良噬斑形成試驗(yàn)測定病毒滴

3、度，根據(jù) Reed-Muench的方法比較分析結(jié)果表明，重組病毒rHMPV NL/1/99-EGFP與野生型HMPV NL/1/99的生長動力學(xué)曲線及最高生長滴度基本一致。rHMPV NL/1/99-EGFP在Vero-E6細(xì)胞連續(xù)傳代10次仍保持綠色熒光蛋白的穩(wěn)定表達(dá)及其所有生物學(xué)特性保持不變。在此基礎(chǔ)上，比較研究了 rHMPV NL/1/99-EGFP（B型）及rHMPV NL/1/00-EGFP(A型)對小鼠和各細(xì)胞的致病性，采用

4、改良噬斑形成試驗(yàn)測定病毒滴度，結(jié)果表明，rHMPV NL/1/00-EGFP的感染性及致病力均比rHMPV NL/1/99-EGFP強(qiáng)。
　　本研究填補(bǔ)了國內(nèi)相同研究領(lǐng)域的空白，首先，重組病毒對外源基因的穩(wěn)定表達(dá)使HMPV具有作為疫苗載體應(yīng)用的可能性。其次，以EGFP蛋白作為病毒示蹤物對實(shí)驗(yàn)條件要求不高，便于檢測，使得在rHMPV NL/1/99-EGFP基礎(chǔ)上進(jìn)行病毒致病機(jī)制和基因功能研究變得更為便利。第三，對兩株重組HMPV致