增強(qiáng)綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1-Rapsyn-Musk的構(gòu)建.pdf

1、目的:應(yīng)用基因融合技術(shù),構(gòu)建含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因和突觸受體相關(guān)蛋白、肌肉特異性受體酪氨酸激酶重組融合基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1/Rapsyn/MuSK。
　　 方法:
　　 1、通過(guò)高保真PCR法,以pcDNA-Rapsyn為模板獲得Rapsyn目的基因,凝膠回收后用限制性內(nèi)切酶雙酶切法將目的基因連接至真核表達(dá)載體pEGFP-N1,并轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞。然后用NheI和XhoI雙酶切篩選陽(yáng)性單克隆

2、重組子,獲得預(yù)期結(jié)果后進(jìn)行序列測(cè)定、序列比對(duì)。
　　 2、通過(guò)高保真PCR法,以pcDNA-MuSK為模板獲得MuSK目的基因,凝膠回收后用限制性內(nèi)切酶雙酶切法將目的基因連接至真核表達(dá)載體pEGFP-N1,并轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞。然后用XhoI和EcoRI雙酶切篩選陽(yáng)性單克隆重組子,獲得預(yù)期結(jié)果后進(jìn)行序列測(cè)定、序列比對(duì)。
　　 3、用NheI和XhoI分別雙酶切測(cè)序正確的pEGFP-N1/Rapsyn和pEGF

3、P-N1/MuSK,凝膠回收Rapsyn基因片段和線性pEGFP-N1/MuSK并連接,轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞后,用NheI和EcoRI雙酶切篩選陽(yáng)性單克隆重組子,獲得預(yù)期結(jié)果后進(jìn)行序列測(cè)定、序列比對(duì)。
　　 結(jié)果:
　　 1、通過(guò)高保真PCR法以pcDNA-Rapsyn為模板擴(kuò)增出了1252bp的DNA片段,構(gòu)建篩選的陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切得到在MarK1200bp附近的DNA片段,大小與預(yù)期結(jié)果相符,測(cè)序結(jié)果與

4、目的基因Rapsyn序列(已測(cè)序并BLAST)通過(guò)Vector NTISuite8軟件比對(duì)后一致。
　　 2、通過(guò)高保真PCR法以pcDNA-MuSK為模板擴(kuò)增出了2657bp的DNA片段,構(gòu)建篩選的陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切得到在Mark2000bp和3000bp之間的DNA片段,大小與預(yù)期結(jié)果相符,測(cè)序結(jié)果與目的基因MuSK序列(己測(cè)序并BLAST)通過(guò)Vectot NTI Suite8軟件比對(duì)后一致。
　　 3、構(gòu)建篩選