版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領
文檔簡介
1、2 7 8· 論著 ·!=!塑胞 王魚堂圭( C h i nJC e l lM o 1I m m u n o 1 ) 2 0 0 4 . 2 0 ( 3文章 編號 : 1 0 0 7— 8 7 3 8 ( 2 0 0 4 ) 0 3— 0 2 7 8— 0 4h J a g g e d l 既 ‘ - F c融合 蛋 白真 核 表達 載體 的構(gòu) 建和 表 達 賈洪霞 ,張 萍 , 周 鵬 ,李軍鋒! , 韓
2、驊 ,梁英 民 ( 第四軍醫(yī)大學 :唐都醫(yī)院血液科 , 陜西 西安 7 1 0 0 3 8 ;基礎部醫(yī)學遺傳學與發(fā)育生物學教研室 , 陜西 西安 7 1 0 0 3 2 )Co n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o no faf u s i o np r o t e i nc o n t a i n i n ge x t r a c e l l u l a rd o m a i no fh
3、 u ma nJ a g g e d la n dF cf r a g m e n to fh u m a nI g G1J l AH o n g — x i a t .Z H A NGP t n g, Z HO UP e n g. L IJ u n .g,HANHu a,L I A NGY i n g- mi n IDe p a r t me n to fHe ma t o l o g y , T a n g d uHo s p i
4、t a l , Xi ’ a l l71 0 0 3 8;De p a r t me n to fM e d i c a lGe n e t i c sa n dDe v e l o p me n t a lBi o l o ~“ ,F(xiàn) o u r t hMi l i t a r yMe d i c a l Un i v e r s i t y ,Xi ’ a n71 0 0 3 2,Ch i n aAb s t r a c tAI
5、M :T oc on s t r u c tae u k ar y o t i ce x p r es s i onv e c t o rc o n t a i n i n gt h ee x t r a c e l l u l ard o ma i no fh u ma nJ a g g ed lan dFcf r a g me n to fh u ma nI g Glf u s i o ng e n ea n dt oe x p r
6、 e s st h eh J a g g e dle x t _F Cf u s i onp r o t e i ni nma mma l i a nc e l l s .METHODS:Th ee x ·t r a c el l u l a rd omai no fh u ma nJ ag g e dlg en ewa scl on edf r 0 m n or malh u ma nb on emar r ow c e l
7、 l s .I no r d e rt oo b t ai nh J a g g e dl e x tF Cf u s i ong e n e, t h ee x t r ac el l ul ardo ma i no fJ a g—g e dlg en ewa si n s e r t e di n t opBl u e s c r i p t - s kf l- h c yl,an dt h e nt h ef u s i o ng
8、e n ewa si n s er t e di n t op EF- BOSn e ot og e tt h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i onv e c t orp EF- BOSn e o - h J a g ge dl 。-F c .T h er e c o mb i n a t i o np l a s mi dwa st r a n s i e n t l yt r a n s f
9、e c t e di n t oCOS7c e l l sa n dt h ee x pr e s s i o no ft h ef u s i o npr o t e i nwa si d e n t i f i e db yRT - P CR,i mmu n o f l u o r e s c e n ta s s a ya n ds a n d —wi c hE L I S A.RE S I J L T S: Th ee x t
10、r a c e l l u l a rd o ma i no fh u ma nJ a g g e d!g e n ewa s e f e c t i v e l ya mp l i f i e d.Th eDNA s e q u en 。c i n gr e s u ls h o we d t h a tt h ec o n s t r u c t e dp l a s mi dc o n t ai n i n gh J a
11、 g g e dl e x t_ F cf u s i o ng en ewa st h es a mea sd e s i g n e d.Th ef u s i onpr ot e i nwa ss u c c e s f u l l ye x pr e s s e di nma mmal i a nc e l l s .CONCLUS I ON:Th eh J a g ge dlg en eh a sb e enS U C —c
12、e s s f u l l yc l on e da n de x p r e s e d,whi c hp r o v i de san e w f u -s i 0 np r ot e i nf orf ur t he re x p e r i me n t s.f o re x a mp l e.t h eJ ag —g e dl. F cf u s i o np r ot e i nc a nb eu s e da san e
13、 w s t i mu l a t o rf orp r o l i f e r a t i o no fh e ma t o p o i e t i cs t e r n / p r o g e n i t o rc e l l s/ nv i t r o .收稿 日期 : 2 0 0 3— 0 7— 1 9 ; 修 回 E t 期 : 2 0 0 3 — 0 9—1 8基金 項 目 :國 家 重 點 基 礎 研 究 發(fā) 展 規(guī) 劃
14、 ( 9 7 3 ) 資 助 項 目( N o . 0 0 t —C B 5 0 9 9 0 6 ) ;國 家 自然科 學基 金資助 項 目( N o . 3 0 2 0 0 1 4 8 )作者 簡介 :賈洪霞 ( 1 9 7 5一) , 女 , 山 東德 州人 , 碩 士生.T e l : ( 0 2 9 ) 8 3 3 7 4 4 9 0 ; E m a i l : j h x l 2 1 8 8 3 @ s i n a . c o
15、 w lC o r r e s p o n d i n ga u t h o r ,E ma i l : l i a n g ? ' m@ f m mu . e d u . C HKe y wo r ds : h e ma t op oi e t i cs t e r n /p r o g en i t orc e l l s; Not c h;J ag g e d 1;f u s i o np r o t e i n;eu k
16、 ar y o t i ce x pr e s i o n摘要 目的: 構(gòu)建含人 J a g g e d l胞外段- I g F c融合基 因片段 的質(zhì)粒 ,并在真核細胞 中表達。方法 : 從人骨髓 細胞 中用 R T . P C R擴 增 h J a g g e d 1 基因的胞外段。經(jīng) D N A測序后, 將 h J a g g e d l 基因 的胞 外 段 插 入 改 造 過 的 質(zhì) 粒 p B l u e s c r i p
17、ts kI I中,獲 得 h J a g g e d l· F c 融合基因。將融合基因插入真核表達載體 p E F .B O S n e o , 構(gòu)建真核表達載體 p E F - B O S n e o - h J a g g e d l‘ - F c 。以其 瞬時 轉(zhuǎn)染 C O S 7細胞 , 應 用 R T - P C R、 細胞 免疫 熒 光技 術 , 及夾 心 E L I S A檢測融合蛋 白的表達。結(jié)果: h J
18、a g g e d l 基 因的胞外 段 被 有 效 地 擴 增。 D N A 序 列 分 析 表 明,所 構(gòu) 建 的 含 h J a g g e d l- F c 融合基 因的質(zhì)粒 與設 計相 同, h J a g g e d l “ ‘ - F c 融 合蛋白得到正確表達。結(jié)論 : 成功地構(gòu)建 了 h J a g g e d l- F c 融 合基因的真核表達載體 , 并 在真核細胞 中正 確表達 ,為進一 步研究 J a g g
19、e d l 在造血干/ 祖細胞的體外擴增奠定 了基礎。關鍵詞: 造血干/ 祖細胞 ; N o t c h ; J a g g e d l ; 融合蛋 白; 真核表達 中圖分 類 號 : R 3 3 1 . 2 ; Q 7 8文 獻標 識碼 : A造 血干細 胞是 一 群存 在 于造 血 組織 、 具 有 自我 更新 及定 向分 化 潛能 的造 血細 胞 。 目前 , 對 于 造血 干細胞 的增殖 及分化 的分子調(diào) 節(jié)機制 尚不完全 清楚
20、 ,可能通 過細胞 因子及 細胞 之 間 的相互 接觸 來發(fā) 揮 調(diào) 節(jié)作用 . 2 1 。N o t c h信號途 徑在生 物進 化 中高度 保 守 , 從果蠅 、 線蟲到人 類 ,它廣 泛存 在 于多種 生物 體 內(nèi) , 主要調(diào)控細胞 的分 化方 向 , 與 多種 細胞 、 組織 、 器 官 的生長發(fā)育 有關 引。J a g g e d l 作 為 N o t c h的配體 ,由 12 1 8 個 氨基酸組成 , 屬 I 型跨 膜
21、蛋 白。其胞外 段 含有 1 5個 E G F樣重復序列 , 并含 1 個富含半胱 氨酸 的 D S L( D e l t a . S e r r a t e — L a g 一 2 ) 基 序 ( m o t i f ) ,其 在 與 N o t c h的相互作 用 中起關鍵 作用 。近來發(fā) 現(xiàn) , 在 人造 血干/ 祖 細胞表面存 在 N o t c h受體 的表 達 , 而 在骨 髓 基質(zhì) 細胞 表 面有 J a g g e d
22、l的表 達 ,提 示 N o t c h信號途徑 可能 在造血干/ 祖 細胞 的 自我更新 與增殖 中 起重要作 用。近來有研究 表 明 , N o t c h信 號途 徑可抑 制造血 干/ 祖細胞 的分 化 ,但可 促進 其增 殖 川 。本 研究 中 , 我 們 成功 地構(gòu) 建 了 h J a g g e d l “ ’ 一 F c融合 蛋 白維普資訊 http://www.cqvip.com 2 8 01!Q !=!細胞與分子免疫
23、學雜志( C h i nJC e l lM o lI m m u n o 1 ) 2 0 0 4. 2 0( 32 . 2h J a g g e d l m- F c融合 蛋 白真 核 表達 載 體 的構(gòu) 建 挑取 含測 序正確 h J a g g e d l‘ 基 因的克隆 , 以 E c o RI單酶切后補平 , 將 目的片段插 入改造 過 的 p B l u e s c r i p ts kⅡ 中 , 以 獲 得 h J a g
24、g e d 1一 F c 融 合 基 因 將 h J a g g e d 1一 F c 融合 基 因插 入 p F F — B O S n e o中,建立 真 核表達載體 p E F — B O S n e o — h J a g g e d l‘ F c 。酶切 所構(gòu) 建 的真核 表達 載體后 , 經(jīng) l Og / L的瓊脂糖凝 膠 電泳 ( 圖 2 ) 顯示 , 構(gòu)建 的重組 載體 用 S a cI 和 nI 酶切 可切 出 2 .
25、 8k b及 8 . 9k b的兩條 帶 ,同預期 的結(jié) 果一致 。圖 2 真核表達載體 p E F — B O S n e o . h J a g g e d 1‘ 一 F c 的酶切鑒定 F i g2Re s t r i c t / o ne n z y med i g e s t i o na n a l y s i so ft h ee u k a r y o t i ce x —p r e s s i o nv e c t o
26、 rp EF — BOS n e o — h J a g g e d l‘ 一 F c1 :D NAma r k e r ;2:p E F — B OS n e o — h J a g g e d 1一 F cd i g e s t e dw i t hS a cIa u dK o nI .2 . 3h J a g g e d l m- F c融合 蛋 白的表 達及 檢 測 為 了 在真核細 胞 中表 達 h J a g g e d l
27、一 F c融合蛋 白,我們 用 p E F — B O S n e o - h J a g g e d ll _ F c 轉(zhuǎn) 染 C O S 7細 胞 ,并 用 以 下方 法 檢 測 了 h J a g g e d 1F c融 合 蛋 白 的 表 達 。 首 先 , 用 R T - P C R檢測轉(zhuǎn)染 細胞 中 h J a g g e d l【 _ F cm R N A的合 成 。用 p E F - B O S n e o — h J
28、a g g e dl一 F c及 p E F — B O S —n e o 瞬時轉(zhuǎn)染 C O s 7后 , 提取細胞 總 R N A并反轉(zhuǎn) 錄成 c D N A, 再用 h J a g g e d l‘ 基 因的上游 引物及 I g G 1F c基 因的下游引物 , 進行 P C R擴增人 h J a g g e d l — F c 融合 基 因。P C R產(chǎn)物經(jīng) l 0g / L瓊脂 糖凝 膠 電泳后 , 結(jié) 果顯 示 , 轉(zhuǎn)染 p
29、E F - B O S n e o - h J a g g e d ll _ F c的 C O S 7細 胞 在 約 41 0 0b p處可見 1 條特異性 的條帶 ( 圖 3 ) , 與預期 的 h J a g g e d l‘ - F c融合基 因的大小相同。膠 回收 目的 條帶 , 酶切鑒 定正 確 ( 未顯 示 結(jié)果 ) ; 而 轉(zhuǎn) 染空 載 體 的 C O S 7細胞 未 出現(xiàn) 此 條 帶 。說 明 h J a g g e d
30、 l一 F c基 因組序列 在 m R N A水 平正 確 拼接 。我們進 一 步用 直 接免疫 熒 光 檢 測 了 h J a g g e d l “ I _ F c融 合 蛋 白在 C O S 7細胞 中的表 達 。以 F I T C標記 的 鼠抗 人 F c抗 體對 轉(zhuǎn) 染 細胞進 行 染色 ,發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn) 染 p E F — B O S n e o — h J a g g e d le x t —F c的 C O s 7細胞 染 色
31、 呈 陽性 ,陽性 物 質(zhì)多 位 于 核周 質(zhì)或 呈簇狀 分 布 ,提示 表達 的 h J a g g e d l【 _ F c融合 蛋 白多 于 內(nèi)質(zhì) 網(wǎng) 中( 圖 4 ) 。最后 ,我們 用 夾 心 E L I S A檢 測 了細胞 培養(yǎng) 上 清 中 h J a g g e d l‘ 一 F c融合 蛋 白的分 泌 表 達 情 況 。 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) , 轉(zhuǎn) 染 p E F — B O S n e o —h J a g g e d
32、ll _ F c的 C O S 7 細 胞 的 培 養(yǎng) 上 清 ,檢 測 到 h J a g g e d ll _ F c融合蛋 白 的表 達 ;而空 載體 轉(zhuǎn) 染 組 及 正常細胞培養(yǎng) 上清 中均為 陰性 ( 表 1 ) 。b p2 3 l 3065 5743 6 123 224 l 0 0圖 3h J a g g e d le x [ 一 F c 融合基 因 R T — P C R產(chǎn) 物的瓊脂糖凝膠 電 泳分 析 F i g3An
33、a l y s i so fP CR p r o d u c to fh J a g g e dl — F cf u s i o ng e n eb ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s1 :DN Ama r k e r ;2 :CO S 7c e l l st r a n s f e c t e dw i t hp E F — B O S n e o — h J a g g
34、 e d le x t .F c:3:COS 7c e l l st r a n s f e c t e dwi t hp EF— BOS n e o .圖 4h J a g g e d l‘ 一 F c 融合蛋白在 C O S 7細胞中的表達 F i g4E x p r e s s i o no fh J a g g e d l一 F cf u s i o np r o t e i ni nC O S 7c e l l sA:C OS
35、 7c e l l st r a n s f e e t e dw i t hp E F — B O S n e o (×4 O 0);B:C OS 7c e l l st r a n s f e e t e dw i t hp E F — B O S n e o — h J a g g e d l一 F c (× 2 0 0 ) .表 1 轉(zhuǎn)染細 胞培 養(yǎng)上清 中 h J a g g e d l一 F c融合蛋 白
36、表達 的 E L I S A檢 測 T a b1De t e c t i o no ff u s i o np r o t e i ni nt h ec u l t u r es u p e m a t a n to f t r a n s f e c t e dC OS 7c e l l sb ys a n d wi s hE LI S A ( n=3 ,± s )S o u r c eo fc u l t u r es u
37、 p e r n a t a n tA 4 l 0n mv a l u eF u s i o ng e n e — t r a n s f e c t e dC O S 7c e l l s0 . 2 6 5±0 . 0 0 6Emp t yp l a s mi d— t r a n s f e c t e dCOS 7c e l l s0. 0 01±0. 0 01COs 7c e l l s一0. O 0l
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表達載體的構(gòu)建及表達.pdf
- 重組低氧誘導因子1α基因真核表達載體的構(gòu)建和表達研究.pdf
- TNFRBP-hlgG1Fc融合蛋白構(gòu)建、真核表達及生物學活性研究.pdf
- Vγ9Vδ2融合片段原核表達載體的構(gòu)建和蛋白純化.pdf
- 人白介素2受體γ鏈胞外區(qū)真核表達載體的構(gòu)建和表達.pdf
- IER5原核表達載體的構(gòu)建及融合蛋白表達、純化.pdf
- hTERT真核表達載體的構(gòu)建與表達.pdf
- 人α-乳清蛋白基因真核表達載體的構(gòu)建及原核表達.pdf
- pegfp-pdx-1真核表達載體的構(gòu)建
- pegfp-pdx-1真核表達載體的構(gòu)建
- HIV-1膜融合抑制劑的原核表達、純化及真核載體的構(gòu)建和活性檢測.pdf
- 人BRCA1真核表達載體的構(gòu)建及表達.pdf
- 以β-淀粉樣蛋白為靶的單價及二價真核表達載體的構(gòu)建和表達.pdf
- 人GITR-,aa1-165-真核表達載體的構(gòu)建及蛋白表達.pdf
- 真核表達載體pcdna3.1tmfactorxaepo的構(gòu)建及融合蛋白在hela細胞中的表達純化
- 空腸彎曲菌peb1A基因原核表達載體的構(gòu)建和表達.pdf
- 人TRAIL原核表達載體的構(gòu)建和表達與純化.pdf
- 重組四價Aβ-,1-15-原核表達載體的優(yōu)化構(gòu)建和表達.pdf
- 長效GLP-1-IgG2σFc融合蛋白的真核表達與生物活性鑒定.pdf
- 截斷型人轉(zhuǎn)化生長因子受體Ⅱ真核表達載體的構(gòu)建和表達.pdf
評論
0/150
提交評論