AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表達載體的構建及表達.pdf

1、重癥肌無力（myastheniagravis，MG）是一種典型的抗體介導、補體參與的器官特異性自身免疫性疾病，煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinicAcetylcholinereceptor，nAChR）抗體是其發(fā)病的重要效應因子。臨床表現(xiàn)主要為橫紋肌無力，嚴重時可累及呼吸肌，危及生命。
　　現(xiàn)有治療手段主要為膽堿酯酶抑制劑、皮質激素、免疫抑制劑、血漿置換、靜脈注射免疫球蛋白、胸腺切除術等，能一定程度控制病情，但不能抑制病程發(fā)展，

2、且會影響全身免疫系統(tǒng)。致病性B細胞分泌產生AChR抗體，是MG發(fā)病的關鍵因子，若能從源頭上清除這類B細胞則有望控制MG病情。
　　本研究希望通過真核表達載體轉染CHOk1細胞以獲得一種AChRIgG‐Fc融合蛋白，該融合蛋白可與分泌AChR抗體的致病B細胞表面抑制性受體FcγRBⅡ或單核‐巨噬細胞表面的Fcγ受體特異性結合，抑制B細胞活化并促進其凋亡。
　　以人nAChRα1亞基全序列為模板，以PCR法擴增AChRα1亞基胞

3、外段主要免疫區(qū)基因片段Hα1-121，將其插入真核表達載體pAN1782。將構建的新載體轉染至CHOk1細胞，建立穩(wěn)定表達AChRIgGFc‐融合蛋白的CHOk1細胞株，以Westernblot法檢測AChRIgGFc‐融合蛋白表達。
　　結果顯示Hα1-121經(jīng)PCR法擴增后所獲428bp基因片段大小符合預計結果，測序所得核苷酸序列與人類基因庫中AChRα1亞基胞外段基因片段Hα1-121序列完全一致，未出現(xiàn)點突變或移碼突變。所

4、構建的新載體經(jīng)酶切鑒定證實片段插入正確，載體構建成功。Westernblot法檢測結果顯示轉染新載體的CHOk1細胞培養(yǎng)上清液中有AChRIgGFc‐融合蛋白表達。
　　綜上所述，成功構建人AChRIgGFc‐段融合蛋白真核表達載體，且該融合蛋白可在轉染新載體的CHOk1細胞中穩(wěn)定表達，為下一步靶向B細胞治療重癥肌無力奠定了初步基礎。
　　EAMG是MG的動物模型，是研究MG發(fā)病機制、治療策略的重要手段。我們采用重組表達的人