綠色熒光蛋白標(biāo)記的乙肝病毒全基因組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)分析.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)為一種嗜肝DNA病毒，其感染具有種屬特異性和組織特異性，人類HBV僅感染人和高等靈長類動(dòng)物，具有肝組織特異性，這在一定程度上限制了人們對(duì)HBV在致病機(jī)制和防治等HBV相關(guān)的醫(yī)藥生物學(xué)問題的研究。近年來，國內(nèi)外采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，建立了多種HBV單基因或全基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，這部分解決了HBV小鼠模型缺乏的局面，但是由于全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠血清和組織(尤其是肝組織)中有HBV病毒蛋白的表

2、達(dá)和病毒的復(fù)制，因此，在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠的培育和其他研究具有一定的危險(xiǎn)性，且常規(guī)分子生物學(xué)方法和免疫組織化學(xué)的方法檢測有代價(jià)較高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的限制。因此，建立一種便于檢測和培育的全基因組小鼠具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。建立一種全身組織可表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠，可以簡化轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測和培育。通過本課題的研究，得到GFP標(biāo)記的HBV真核表達(dá)載體，并利用其制備轉(zhuǎn)基因小鼠。 本研究采用基因重組技術(shù)，將

3、pBR322HBVadr2.0質(zhì)粒(含有雙拷貝的HBV全基因組DNA)和pCXEGFP質(zhì)粒(含CMV-IEenhancer和Chickenβ-actionpromoter調(diào)控的EGFP基因)分別用限制性內(nèi)切酶PvuⅡ和BamHⅠ酶切，T4DNA多聚酶將粘性末端平端化后，再用限制性內(nèi)切酶SalⅠ酶切，膠回收得到EGFP和HBVadr2.0片段，連接后構(gòu)建成pCXEGFP-HBVadr2.0真核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測定，

4、證實(shí)該載體構(gòu)建成功。為了研究pCXEGFP-HBVadr2.0載體的體外表達(dá)特征，將該載體線性化后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將其轉(zhuǎn)染人胎肝細(xì)胞系L02，無限稀釋法獲得穩(wěn)定遺傳pCXEGFP-HBVadr2.0的L02陽性細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察表明pCXEGFP-HBVadr2.0可在L02細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白，進(jìn)一步采用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測HBs基因和HBc基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況，結(jié)果顯示，HBs基因和HBc

5、基因可在穩(wěn)定遺傳pCXEGFP-HBVadr2.0的L02陽性細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。為了證實(shí)pCXEGFP-HBVadr2.0在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況，該研究采用尾靜脈液壓注射方法，通過尾靜脈將pCXEGFP-HBVadr2.0直接注射入正常小鼠體內(nèi)，分別在質(zhì)粒注射后24，48，72小時(shí)取小鼠肝組織塊制成冰凍切片，采用熒光顯微術(shù)和免疫組織化學(xué)的方法檢測pCXEGFP-HBVadr2.0表達(dá)的情況。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，注射小鼠肝臟組織中表達(dá)GFP

6、，其表達(dá)量(熒光亮度)在細(xì)胞間有差別。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HBsAg，HBcAg在注射小鼠肝臟組織中均有表達(dá)，陽性細(xì)胞散在分布。以上研究結(jié)果證實(shí)，本研究已成功構(gòu)建了pCXEGFP-HBVadr2.0真核表達(dá)載體，該載體可在體外和體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，這為體外研究HBV和制備轉(zhuǎn)基因小鼠奠定了基礎(chǔ)。為了制備可表達(dá)綠色熒光蛋白的HBV全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠，本研究將構(gòu)建成功的pCXEGFP-HBVadr2.0真核表達(dá)載體用PstⅠ、NheⅠ限制

7、性內(nèi)切酶線性化，純化后采用經(jīng)典的顯微注射法，將10kb大小的DNA片段注射入供體小鼠受精卵雄原核，共注射72枚受精卵，選取狀態(tài)較好的64枚，分別植入5只假孕小鼠，其中2只已經(jīng)懷孕，待產(chǎn)仔后做轉(zhuǎn)基因鑒定。 總之，本課題成功構(gòu)建了含有雙拷貝HBV全基因組DNA和EGFP基因的真核表達(dá)載體pCXEGFP-HBVadr2.0，體內(nèi)體外研究證實(shí)GFP和HBV基因均能表達(dá)，表明pCXEGFP-HBVadr2.0可用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備，且GF