綠色熒光蛋白標(biāo)記的非抗性示蹤載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、隨著微生物學(xué)研究的不斷深入，研究者們迫切需要一種可以直接在活組織或動物消化道的任何時候隨時被檢測到的細(xì)胞標(biāo)記物(cell marker)，從而可跟蹤活的受體菌株中的分子事件。綠色熒光蛋白基因相對于其它報告蛋白基因在原位、實時的微生物生理生化研究中有很多優(yōu)越性，受到越來越廣泛的關(guān)注。本研究應(yīng)用綠色熒光蛋白基因作為報告基因，構(gòu)建了非抗生素抗性的示蹤表達(dá)載體pW425t-GFP，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌X13。成功獲得表達(dá)綠色熒光蛋白基因的大腸桿菌

2、pW425t-GFP，在無抗生素壓力選擇情況下，連續(xù)培養(yǎng)10代，綠色熒光蛋白在重組菌中能獲得穩(wěn)定表達(dá)。最后將上述重組菌pW425t-GFP口服接種BALB/c小鼠，觀察其在消化道中的分布。具體研究內(nèi)容如下： 首先根據(jù)質(zhì)粒PGFP uv的綠色熒光蛋白基因序列設(shè)計了一對引物，以載體質(zhì)粒為模板，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，擴增了938bp的含有LacZ啟動子的GFP全基因。通過T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T-Ve

3、ctor中，轉(zhuǎn)化至受體菌JM109中，通過質(zhì)粒提取、限制性內(nèi)切酶酶切、PCR、序列測定等方法鑒定構(gòu)建出重組陽性克隆質(zhì)粒pGEM-T-GFP。經(jīng)DNASTAR軟件分析核苷酸序列，結(jié)果顯示該基因與Genbank上紀(jì)錄的GFP基因序列同源性達(dá)到100％。 然后應(yīng)用基因體外重組技術(shù)，將ThyA/紅霉素雙抗性表達(dá)載體pW425et中的紅霉素抗性基因替換為含有強啟動子的GFP基因，構(gòu)建了非抗生素抗性的示蹤表達(dá)載體pW425t-GFP，通過質(zhì)

4、粒提取、限制性內(nèi)切酶酶切、PCR等方法鑒定構(gòu)建出的重組陽性表達(dá)載體pW425t-GFP，并通過SDS-PAGE電泳檢測綠色熒光蛋白基因的表達(dá)量。經(jīng)熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示該表達(dá)載體能穩(wěn)定的表達(dá)出綠色熒光蛋白，并能發(fā)出穩(wěn)定的綠色熒光。在無抗生素壓力選擇情況下，連續(xù)培養(yǎng)10代，綠色熒光蛋白在重組菌中能獲得穩(wěn)定表達(dá)。 將上述獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的重組菌給小鼠口服，觀察該重組菌在胃腸道中的分布。重組菌口服接種4周齡BALB/c小鼠，

5、于接種后2，6，12，24，48和72h.......分別取胃腸內(nèi)容物接種培養(yǎng)并計數(shù)，同時取胃、空腸、回腸和盲腸做冷凍切片，在熒光顯微鏡下觀察重組菌的分布。結(jié)果表明重組菌pW425t-GFP在接種小鼠6h后，胃腸道的內(nèi)容物中可發(fā)現(xiàn)pW425t-GFP。在42h時細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最大，并且3d后胃腸道中仍存在一定數(shù)量(約10<'4>CFU/g)的重組菌。表明該重組菌可較長時間的定植于腸黏膜表面。在熒光顯微鏡下可清晰的觀察到pW425t-GFP