蘭科菌根真菌與蘭科植物黃花白及的共生關(guān)系研究及綠色熒光蛋白標(biāo)記體系的初步構(gòu)建.pdf

1、近年來(lái),蘭科植物及其菌根真菌共生關(guān)系的研究成為一個(gè)熱門話題。在自然條件下,蘭科植物種子的萌發(fā)和植株的生長(zhǎng)都離不開菌根真菌的參與。黃花白及(Bletilla ochrace Schltr.)是一種地生蘭科植物,也是貴州省境內(nèi)重要的中藥材之一。近年來(lái)由于人們的過(guò)度采挖和生境的破壞,導(dǎo)致其野生資源日趨瀕危。
　　本研究通過(guò)對(duì)蘭科植物黃花白及菌根真菌的分離,將分離的的菌根真菌與黃花白及種子重新構(gòu)建建立共生體系,篩選并鑒定出對(duì)黃花白及種子有

2、促生作用的真菌種類,并嘗試建立促生真菌 Sebacina sp.綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化體系。上述研究將為深入研究蘭科植物與菌根真菌的相互作用,進(jìn)一步研究蘭科植物與內(nèi)生真菌之間的關(guān)系提供新的思路和借鑒,也為菌根真菌在野生蘭科植物人工馴化中的作用提供理論依據(jù)。本研究具體研究結(jié)果如下:
　　1.采用傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法,分離黃花白及的菌根真菌,通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定兩株有促生作用的菌根真菌,分別為Epulorhiza sp.

3、和Sebacina sp.。
　　2.分別將Epulorhiza sp.和Sebacina sp.兩株菌根真菌與黃花白及種子進(jìn)行共生萌發(fā),Epulorhiza sp.和Sebacinasp.兩株菌根真菌對(duì)黃花白及種子的萌發(fā)具有顯著的促進(jìn)作用,比對(duì)照的萌發(fā)率分別高出8.61％和18.43%,并且將共生體切片顯微觀察,在黃花白及萌發(fā)的種子組織中觀察到典型的蘭科菌根結(jié)構(gòu)。
　　3.建立 Sebacina sp.菌根真菌原生質(zhì)體的制

4、備方法,原生質(zhì)體制備的優(yōu)化條件為:液體YEPG中培養(yǎng)了60 h的新鮮幼嫩菌絲,在28℃下,使用裂解酶(10 mg/ml)與崩潰酶(20 mg/ml)作為組合酶解液、1.2 mol/L KCl酶解1.5h,原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到5×107個(gè)/ml。
　　4.本研究對(duì) Sebacina sp.的原生質(zhì)體進(jìn)行 CaC12-PEG介導(dǎo)的GFP基因的遺傳轉(zhuǎn)化和對(duì) Sebacina sp.菌絲進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)(ATMT)的GFP基因的遺傳轉(zhuǎn)化的初