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文檔簡介
1、目的1、建立并利用畢赤酵母Pichia pastoris真核表達系統(tǒng)表達凋亡抑制因子Survivin蛋白.方法1、利用Survivin的特異引物,通過PCR法從重組質(zhì)粒pGEX-4T-3-HA-Survivin中擴增人Survivin基因的DNA全長,并將Survivin基因克隆于pGEM-T載體,進行序列測定;2、將序列正確的Survivin基因與穿梭載體pPic9k重組,大量擴增重組體后,將重組體酶切線性化,通過電穿孔法轉(zhuǎn)入酵母宿主
2、菌HIS-/GS115細胞中,然后在含不同濃度G418的YPD平板上,篩選陽性克隆.再提取陽性克隆細胞的基因組DNA,用PCR擴增法鑒定陽性克隆;3、用含1％甲醇的BMMY培養(yǎng)基誘導表達蛋白,最后用ELISA法檢測表達產(chǎn)物.結(jié)果1、擴增出的人Survivin片段測序的結(jié)果,與Gen-Bank中的Survivin基因序列對比,序列完全一致,無突變.2、構(gòu)建了真核表達載體pPic9k-Survivin,并將酶切線性化的重組載體轉(zhuǎn)入酵母菌HI
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