快速成形制備的PLGA支架-膠原凝膠復合體構建組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、各種原因造成的軟骨缺損是臨床上常見的問題，由于軟骨的組織學和生物學特性限制了其自身的修復能力，目前尚缺乏有效的治療措施。組織工程技術的發(fā)展為軟骨缺損的修復提供了新的手段，利用具有特定空間結構的支架材料引導軟骨細胞的增殖和基質分泌，最終形成類似正常軟骨組織的結構，并行使功能。
　　近年來軟骨組織工程支架的研究側重于對材料表面的設計以提高材料的生物性能。支架表面特性對細胞/支架復合起重要作用。目前有很多方法，如堿處理、等離子放電和表面

2、改性等都可提高材料表面的生物相容性。
　　在支架材料的研究中，復合材料是目前研究的熱點,即將兩種或兩種以上具有互補理化性質的生物相容性可降解材料,按一定比例和方式組合,可設計出結構與性能優(yōu)化的三維支架材料。以彌補單用人工合成或天然生物材料的缺陷。
　　本研究的目的是構建具有理想空間結構的復合支架材料，即運用快速成形技術制備的PLGA支架材料結合膠原凝膠，探討其作為組織工程支架材料的可行性。
　　本研究包括以下幾部分內容

3、：
　　1.制備具有生物活性的PLGA支架材料：
　　將聚酯PLGA（LA/GA=50/50）充分溶解于1,4-二氧六環(huán)有機溶劑形成無色透明液體。采用清華大學激光快速成形中心開發(fā)研制的低溫擠出成形設備-生物材料快速成形機TissFormTM，經(jīng)計算機輔助設計(CAD)結合低溫擠出成形工藝，在低溫成形室中固化堆積，得到冷凍的三維材料。低溫快速成型的方法所制備的載體框架的孔隙結構、孔隙率、力學性能符合軟骨組織工程載體框架的要求，

4、可以作為軟骨組織工程的支架材料。
　　2.兔關節(jié)軟骨細胞分離培養(yǎng)及生物活性檢測：
　　運用酶消化的方法獲得軟骨細胞，并觀察原代及傳代培養(yǎng)的細胞形態(tài)學變化。用甲苯胺藍及免疫組化的方法鑒定軟骨細胞。成功建立體外培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞的實驗方法。原代培養(yǎng)的軟骨細胞呈多角形,傳代3次后出現(xiàn)去分化。形態(tài)學、免疫組織化學染色顯示細胞培養(yǎng)3代以內可以保持表型的穩(wěn)定。本文建立的體外培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞的方法簡單可行。體外培養(yǎng)的第2代兔軟骨細胞表型穩(wěn)

5、定,細胞增殖活力良好,適用于實驗研究。
　　3.PLGA及膠原改性材料與軟骨細胞相容性的觀察：
　　通過對原始及改性材料與軟骨細胞相容性的觀察，檢測支架材料的生物活性。包括親水性的測定，細胞計數(shù)，掃描電鏡。實驗證實，改性后材料親水性及細胞黏附率較改性前支架均有顯著性提高。
　　4.膠原凝膠包埋軟骨細胞復合快速成形PLGA支架的接種方法：
　　通過將膠原凝膠包埋的軟骨細胞接種到快速成形的PLGA材料上并進行體外培養(yǎng)

6、觀察，細胞計數(shù)檢測細胞粘附情況，倒置顯微鏡觀察細胞在支架內分布的均一性。結果顯示，90％以上的細胞能夠有效、均勻接種于支架材料上，所以，膠原凝膠包埋軟骨細胞三維接種能有效提高種子細胞的接種效率，防止細胞流失。
　　5.裸鼠體內成軟骨實驗：
　　通過將膠原凝膠包埋的軟骨細胞接種到快速成形PLGA材料的復合物植入裸鼠體內于不同時間點進行大體觀察，組織學染色檢查軟骨形成情況。大體觀察，有類軟骨樣組織形成，所形成的組織形態(tài)保持良好，

7、具有一定的厚度，未見收縮。組織學結果顯示軟骨細胞在體內生長增殖良好,隨時間延長材料逐漸降解軟骨組織逐漸成熟。
　　本實驗證明低溫快速成形技術制備的PLGA支架經(jīng)膠原改性后具有良好的親水性、降解性和生物相容性。凝膠包埋細胞接種支架材料的方法能夠均勻、高效的將細胞固定于多孔材料中，提高細胞接種效率。同時，凝膠包埋的軟骨細胞接種到快速成形的PLGA材料的復合物具有良好的成軟骨能力。所以，膠原凝膠包埋快速成型PLGA支架材料可作為載體復合