蠶絲作為軟骨組織工程支架材料的實驗研究.pdf

1、目的：進一步證實蠶絲具有良好的生物相容性；觀察蠶絲的體內(nèi)降解過程；探討鈣鹽溶解對蠶絲降解性的影響；比較微溶蠶絲、切割蠶絲與PGA在細胞黏附性方面的差異；探討用蠶絲作為組織工程支架體外構(gòu)建軟骨的可行性。 方法：實驗分三個部分：第一部分蠶絲生物相容性及降解性研究，將脫膠后的蠶絲在CaCL．H2O(摩爾比1：8)溶液中按不同時間進行溶解，沉淀于直徑lOmm培養(yǎng)皿底部自然干燥呈圓盤狀，剪刀剪成數(shù)塊3×5mm2大小薄片。取實驗用昆明小鼠5

2、4只，隨機分為：cacl2處理20min組；cacl2處理60min組；未處理組，每組18只，每只小鼠背部皮下埋植3塊材料。埋植術(shù)后1月、2月、3月、4月、6月、8月，每組各處死小鼠2只，取出材料。埋植術(shù)后12月，處死剩余小鼠。行大體觀察、組織學切片觀察蠶絲的降解情況、降解產(chǎn)物對組織的影響及鈣鹽溶解對其降解性的影響。第二部分蠶絲與PGA的細胞黏附性比較研究，通過親水性測試及掃描電鏡觀察切割蠶絲性能及結(jié)構(gòu)變化，取新生兔關(guān)節(jié)軟骨消化分離獲取

3、軟骨細胞，體外培養(yǎng)擴增，將傳至第3代細胞消化下來制成l×105／ml濃度單細胞懸液，以每孔105個細胞(1m1)分別接種子微溶蠶絲材料和切割蠶絲材料及PGA材料上培養(yǎng)24h，然后通過細胞計數(shù)法及MTT法作黏附細胞數(shù)檢測，評價黏附率。第三部分蠶絲復合兔關(guān)節(jié)軟骨細胞體外構(gòu)建組織工程軟骨，選新生兔關(guān)節(jié)軟骨消化分離獲取的原代軟骨細胞為種子細胞，分別試用切割蠶絲及PGA為支架材料，采用體外培養(yǎng)4周構(gòu)建組織工程軟骨。通過倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、組

4、織學及免疫學檢測評價新生軟骨。 結(jié)果：第一部分蠶絲生物相容性及降解性研究結(jié)果：術(shù)后動物無不良反應，術(shù)區(qū)及鄰近皮膚無紅腫、水腫、破潰及異常隆起等。埋植術(shù)后1月、2月、3月、4月時可見材料表面包裹一薄層纖維結(jié)締組織，外形較植入時略有縮小。6個月時cacl2處理60min組發(fā)現(xiàn)1塊材料消失。8個月時cacl2處理20min組有1塊及caclz處理60min組有2塊材料消失。12個月時分別有7塊和9塊消失。以上結(jié)果提示蠶絲已降解可能。組

5、織病理學檢查可見，最初幾月各組均可見異物巨細胞排列于蠶絲周圍，隨月份增加逐漸減少，少見白細胞及淋巴細胞浸潤。體內(nèi)埋植2月后多數(shù)切片均可見蠶絲有裂解現(xiàn)象，cacl2處理60min組較20min組出現(xiàn)早且明顯。6個月的組織切片中可以觀察到蠶絲局部結(jié)構(gòu)消融現(xiàn)象。第二部分蠶絲與PGA的細胞黏附性比較研究結(jié)果：經(jīng)過切割處理，蠶絲親水性明顯增加，掃描電鏡下可見經(jīng)切割后蠶絲表面有更多的微絲剝脫，使得網(wǎng)孔增加、孔隙減小，絲與絲之間連接增加。細胞計數(shù)法測

6、得微溶蠶絲、切割蠶絲及PGA三種材料黏附率分別為67．3％、84．2％、77．8％，MTT法測得三種材料黏附率分別為68．3％、83．3％、77％。各組數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，微溶蠶絲組與切割蠶絲組有統(tǒng)計學差異，切割蠶絲組與PGA組無統(tǒng)計學差異。第三部分蠶絲復合兔關(guān)節(jié)軟骨細胞體外構(gòu)建組織工程軟骨研究結(jié)果：倒置相差顯微鏡下見軟骨細胞接種24h后單個或成團吸附在支架纖維表面或密布于纖維孔隙中。培養(yǎng)5天時，可見大部分纖維上均有細胞纏繞，纖維增粗。培養(yǎng)

7、1周時外觀有所增大，復合物密不透光。復合物培養(yǎng)2周時掃描電鏡下觀察，可見細胞呈多角狀伸展開來，胞外基質(zhì)分泌旺盛，黏附并包繞蠶絲纖維，成片狀沉積覆蓋于材料表面并進入支架內(nèi)部。體外培養(yǎng)4周后，進行組織學檢測，可見蠶絲構(gòu)建的組織工程化軟骨組織能形成近似于正常軟骨的結(jié)構(gòu)。免疫組化檢測可見蠶絲構(gòu)建的軟骨組織中有被染成棕黃色的II型膠原。 結(jié)論：(1)天然蠶絲具有良好的生物相容性，脫去絲膠后埋植皮下1月后少見急性炎癥細胞浸潤。(2)蠶絲體內(nèi)

8、1年左右可以降解，降解產(chǎn)物不產(chǎn)生炎癥反應。(3)經(jīng)過鈣鹽溶解處理后降解時間加快，溶解20分鐘與60分鐘在降解率方面比較無統(tǒng)計學差異，而20分鐘微溶解對蠶絲結(jié)構(gòu)性能影響較小，更適合用作組織工程支架材料。(4)切割蠶絲具有良好的親水性和細胞黏附性，細胞黏附率較未切割組相比較有統(tǒng)計學差異；和PGA相比無統(tǒng)計學差異(5)切割蠶絲纖維制作的支架能夠維持軟骨細胞立體培養(yǎng)的三維環(huán)境條件?？紫洞笮∵m中，利于細胞進入材料內(nèi)部。(6)軟骨細胞在蠶絲支架上生