恥骨聯(lián)合軟骨細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、恥骨間盤與關(guān)節(jié)盤都是纖維軟骨組織，從恥骨聯(lián)合的軟骨組織中是否能夠分離獲取有活性的細(xì)胞、在體外培養(yǎng)、與支架材料復(fù)合生長(zhǎng)、并在體內(nèi)異位形成軟骨組織，是其能否作為構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)盤種子細(xì)胞供體，所必須要首先探討的問題。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)恥骨聯(lián)合及其分離的細(xì)胞進(jìn)行系列研究，探討恥骨聯(lián)合軟骨細(xì)胞是否能夠作為組織工程種子細(xì)胞，為進(jìn)一步的組織工程構(gòu)建關(guān)節(jié)盤做準(zhǔn)備。 本實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分： 實(shí)驗(yàn)一：恥骨聯(lián)合軟骨的形態(tài)學(xué)研究 通

2、過對(duì)取自SD大鼠的恥骨聯(lián)合軟骨組織行HE染色、阿爾辛蘭染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色，觀察到恥骨聯(lián)合軟骨組織中有大量平行和交叉排列的纖維束，軟骨細(xì)胞較小，胞漿嗜堿性著色，呈圓形、卵圓形或短梭形，位于陷窩內(nèi)，分布于纖維束之間，多為成對(duì)存在，或排列成行。細(xì)胞及軟骨陷窩附近阿爾辛蘭染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色著色深，而細(xì)胞外間質(zhì)部分著色較淺。通過對(duì)骨盆標(biāo)本的測(cè)量，發(fā)現(xiàn)成年男性的恥骨聯(lián)合軟骨為一個(gè)前部較厚、后部較薄的楔形片狀組織，軟骨組織量約為1.1

3、3cm3。 實(shí)驗(yàn)二：恥骨聯(lián)合軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及細(xì)胞學(xué)研究 觀察從恥骨聯(lián)合軟骨組織中分離的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過程中的表型、生長(zhǎng)增殖情況。結(jié)果表明：經(jīng)膠原酶分別消化2、6、12h后，平均每100mg恥骨聯(lián)合軟骨在不同消化時(shí)間獲取的原代細(xì)胞數(shù)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P＜0.01)。消化6小時(shí)組可以獲取約(3.03±0.208)×106細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)好。細(xì)胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，線粒體較豐富。第1代細(xì)胞阿爾辛蘭染色、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色

4、均呈陽(yáng)性。Ⅱ型膠原免疫組化染色在第4代細(xì)胞仍呈陽(yáng)性，而在第7代呈陰性。第1、4代細(xì)胞PDT分別為55.5h、56.9h，第7代細(xì)胞中梭形、肥大的細(xì)胞增多，生長(zhǎng)增殖速度明顯減弱，PDT為134.2h。 實(shí)驗(yàn)三：恥骨聯(lián)合軟骨細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究 按5×107個(gè)細(xì)胞每毫升藻酸鈉溶液混合，制備細(xì)胞藻酸鹽凝膠復(fù)合物，觀察細(xì)胞在復(fù)合物中的活性，再將細(xì)胞凝膠復(fù)合物植入裸鼠背部皮下，觀察在體內(nèi)異位形成軟骨組織的情況。結(jié)果見，細(xì)胞

5、分散懸浮在凝膠支架中，細(xì)胞存活率為72.4％±4.5％，保持一定的增殖能力，并可逐漸增殖形成細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞支架復(fù)合物在植入體內(nèi)6周和12周時(shí)，經(jīng)阿爾辛蘭染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色證實(shí)，形成了軟骨島樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：恥骨聯(lián)合軟骨組織體積較大，可以提供較多的軟骨組織用來分離細(xì)胞。從SD大鼠恥骨聯(lián)合軟骨分離獲取的細(xì)胞具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和增殖能力，可以在體外進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。單層培養(yǎng)條件下，第4代及以前的細(xì)胞保留了軟骨細(xì)胞的基本表型特征，