仿生PLGA-軟骨ECM復(fù)合取向支架的制備及其軟骨組織工程的實驗研究.pdf

1、研究背景:作為獲得天然細胞外基質(zhì)的一種新方法,脫細胞技術(shù)是指去除細胞抗原,而保留了組成細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能蛋白。來源于脫細胞組織的的細胞外基質(zhì)在組織工程和再生醫(yī)學上廣泛地研究應(yīng)用。我們前期研究,用改進的聯(lián)合物理和化學的脫細胞方法,得到了脫細胞的軟骨細胞外基質(zhì)(articular cartilageextracellular matrix ACECM),并利用冷凍干燥技術(shù)制備了多孔支架。體內(nèi)外的研究表明:ACECM保留了軟骨基質(zhì)的蛋白多

2、糖(glycosaminoglycans GAGs)和Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡ collagen)成份,提供空間結(jié)構(gòu)和良好的細胞相容性,利于骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的粘附、分化和成軟骨分化。然而,天然來源的生物材料缺乏足夠的力學強度,尤其在含水狀態(tài)。ACECM支架材料也是如此,抗張力和抗壓縮強度低。而理想的軟骨支架應(yīng)該具有結(jié)構(gòu)的完整性,體內(nèi)承載天然軟骨的功能性壓應(yīng)力負荷。
　　 組織工程和再生醫(yī)學的目的是恢復(fù)原始修復(fù)組織的結(jié)

3、構(gòu)和功能。支架的生化組成和結(jié)構(gòu)功能關(guān)系對于優(yōu)化力學和生物學功能至關(guān)重要。支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)能夠仿生所修復(fù)的組織很有意義。關(guān)節(jié)軟骨的膠原纖維有著明顯的分區(qū)排列結(jié)構(gòu),影響軟骨的抗張力和抗壓縮特性。深層軟骨的膠原纖維取向性的垂直與軟骨下骨排列。所以,垂直取向結(jié)構(gòu)的支架與軟骨的生理學和生物力學功能密切相關(guān)。
　　 各種合成的材料(PCL,PLGA,PLA)具有良好的生物相容性和力學強度,廣泛應(yīng)用于組織工程。然而其表面疏水、缺乏利于細胞粘附的

4、生物活性。天然和合成材料具有各自的優(yōu)缺點,它們的復(fù)合支架可以優(yōu)勢互補。合成和天然材料組成的復(fù)合支架具有良好的細胞親和性和力學強度而廣泛應(yīng)用于軟骨組織工程。然而,制備功能性和仿生性的支架仍然是很大的挑戰(zhàn)。
　　 本實驗,制備了取向性的PLGA/ACECM的復(fù)合支架。體外評價該復(fù)合支架的細胞親和性和力學性質(zhì)。同時,自體MSCs加載在該支架上,植入到兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)。再生的關(guān)節(jié)軟骨行組織學染色和大體評價、觀察。更有意義的是:取向性的PLGA

5、/ACECM復(fù)合支架,能否引導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的垂直取向再生;能否誘導(dǎo)MSCs向軟骨細胞方向分化,有待研究證實。
　　 本論文從以下四個部分進行了論述：
　　 第一部分仿生性關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)取向支架的制備及表征
　　 目的:1.制備納米級關(guān)節(jié)軟骨ECM。2.制備ACECM取向支架。3.評估納米級ACECM和ACECM取向支架。
　　 方法:聯(lián)合物理和化學方法對關(guān)節(jié)軟骨脫細胞處理。豬膝關(guān)節(jié)軟骨片懸浮在PBS中,用

6、組織勻漿機的強大剪切力均勻處理而形成懸浮漿料,然后差數(shù)離心。ACECM沉淀用3％TritonX-100和胰酶先后消化脫細胞,DNA和RNA酶去除核物質(zhì)。用熱誘導(dǎo)的相分離技術(shù)制備ACECM取向支架。ACECM漿料和取向支架用電鏡觀察。支架的生化組成以組織學定性分析。
　　 結(jié)果:脫細胞的ACECM呈纖維狀的納米結(jié)構(gòu)。免疫組化證明軟骨特異性collagenⅡ的存在,番紅O陽性染色證明了GAGs的存在。多孔結(jié)構(gòu)及垂直取向結(jié)構(gòu)排列分布均

7、勻。
　　 結(jié)論:聯(lián)合物理和化學脫細胞方法制備了納米級ACECM。熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)制備了取向性的ACECM支架。ACECM取向支架仿生了深區(qū)軟骨的生化組成和形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合ACECM取向支架的體外評估及裸鼠皮下異位成軟骨的實驗研究
　　 目的:1.評估ACECM的生物相容性。2.觀察取向性結(jié)構(gòu)對MSCs生長排列的影響。3.ACECM支架加載軟骨誘導(dǎo)的MSCs裸鼠皮下異位構(gòu)建組織工程軟

8、骨。
　　 方法:分離,擴增和軟骨誘導(dǎo)MSCs接種到取向支架上,電鏡下觀察細胞生長。CCK-8試劑盒量化分析細胞增殖。死活細胞染色評估細胞活力。軟骨誘導(dǎo)分化的MSCs以PKH26熒光標記后裸鼠皮下植入。4周后,活體熒光成像系統(tǒng)分析植入物。植入物組織學染色分析。
　　 結(jié)果:MSCs沿著垂直取向結(jié)構(gòu)聚集排列充滿孔間隙。細胞增殖迅速;除少量死細胞,絕大部分為活細胞粘附在支架上。PKH26有效地標記了MSCs,熒光成像證明:植

9、入物來源于PKH26標記的細胞—支架結(jié)構(gòu)。組織學染色證明:類軟骨樣細胞增殖,新的軟骨基質(zhì)分泌,ACECM維持了分化MSCs的軟骨表型,在體內(nèi)形成了類軟骨樣組織。
　　 結(jié)論:ACECM提供微環(huán)境利于MSCs粘附增殖。接種的細胞沿著取向結(jié)構(gòu)排列。PKH26熒光標記的MSCs體內(nèi)得到追蹤,ACECM在體內(nèi)維持MSCs的軟骨分化能力。
　　 第三部分仿生PLGA/納米ACECM復(fù)合取向支架的制備及體外評估
　　 目的:

10、1.制備PLGA/ACECM取向復(fù)合支架。2.評估取向支架的力學強度。3.評估復(fù)合支架的細胞活性。
　　 方法:支架制備方法與制備ACECM取向支架相同。支架在干燥和濕潤狀態(tài)下的力學分析采用測試壓縮模量的方法進行。細胞增殖和活性分別采用CCK-8和死活染色的方法。
　　 結(jié)果:取向復(fù)合支架的結(jié)構(gòu)與單存ACECM支架相似。在干燥狀態(tài)下,復(fù)合支架的壓縮模量為4.20±0.17MPa,ACECM支架為2.20±0.17MPa。

11、在濕潤狀態(tài)下,ACECM支架僅為0.11±0.01MPa,而復(fù)合支架為1.03±0.1MPa。復(fù)合支架的細胞增殖性和活性要優(yōu)于PLGA支架。
　　 結(jié)論:用熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)制備了PLGA/ACECM取向復(fù)合支架。該支架具有良好的親水性和細胞親和性。復(fù)合支架較ACECM支架有更高的力學強度,尤其在含水狀態(tài)下。
　　 第四部分自體骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合PLGA/ACECM取向支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損
　　 目的:1.復(fù)

12、合取向支架修復(fù)軟骨缺損。2.取向性的復(fù)合支架引導(dǎo)軟骨取向性再生。3.ACECM在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)MSCs向軟骨方向分化。
　　 方法:取向性的復(fù)合支架加載自體MSCs后,植入到兔的關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū),以單純支架和空白曠置作為對照組。術(shù)后12W和24W后,修復(fù)的軟骨以組織學和免疫組化分析評估。
　　 結(jié)果:術(shù)后24W,軟骨缺損以透明軟骨修復(fù)。再生的關(guān)節(jié)軟骨沿著垂直取向排列。
　　 結(jié)論:PLGA/ACECM復(fù)合支架能夠修復(fù)