軟骨組織工程載體——關(guān)節(jié)軟骨源性支架的系列研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷較為常見，而軟骨自身修復能力極其有限。雖然軟骨缺損的修復方法有很多種，如鉆孔、微骨折技術(shù)、自體骨膜移植等，但都不盡如人意。隨著組織工程的發(fā)展，利用組織工程軟骨修復軟骨缺損展示了誘人前景。理想的支架是組織工程成功構(gòu)建的關(guān)鍵一環(huán)。目前，已有多種材料被制備成不同結(jié)構(gòu)的支架，如PLGA、殼聚糖、藻酸鹽和Ⅰ型膠原等，但是，從仿生學角度分析，這些材料均不具備細胞外基質(zhì)的功能和作用，本身缺乏軟骨細胞特定的細胞識別信號。因而，我們把方向逐漸

2、轉(zhuǎn)向了關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)。 首先建立了人關(guān)節(jié)軟骨脫細胞基質(zhì)的制備方法，簡述如下：把關(guān)節(jié)軟骨剪裁成一定大小的軟骨塊，凍干后對之進行如下脫細胞處理：①把關(guān)節(jié)軟骨放入含蛋白酶抑制劑的低滲Tris-HCL(Ph7.4)緩沖液4℃持續(xù)振蕩24h；②用1％TritonX-100、Tris-HCL液(V/V)內(nèi)加蛋白酶抑制劑4℃持續(xù)振蕩48h后取出，標本用蒸餾水徹底沖洗；③用DNase和RNase混合液37℃消化過夜；④重新置入1％TritonX-

3、100、Tris-HCL液中，4℃洗脫24h，取出后用蒸餾水沖洗48h。結(jié)果顯示細胞陷窩內(nèi)已無細胞結(jié)構(gòu)；番紅花0染色陽性；軟骨蛋白聚糖、Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性。結(jié)果證實：人關(guān)節(jié)軟骨凍干后，經(jīng)去污劑-酶等方法處理后可脫去軟骨的細胞成分，并且保留了軟骨細胞外基質(zhì)，成功制備了人關(guān)節(jié)軟骨脫細胞基質(zhì)。但經(jīng)壓汞法檢測，其孔隙率僅僅45％，過低，使用這種方法制備的材料作為軟骨組織工程支架仍欠理想，需要進一步改進。 接著，建立了關(guān)節(jié)軟骨源性微

4、載體的制備方法，并成功制備出關(guān)節(jié)軟骨源性微載體。方法簡要如下：切取關(guān)節(jié)軟骨，對之冷凍干燥后，經(jīng)粉碎機粉碎，篩取200-150um大小的軟骨粒，經(jīng)0.25％胰酶在37℃消化24小時，再經(jīng)1％的化學去污劑TritonX-100震蕩72小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：倒置顯微鏡下見軟骨粒變?yōu)榻q球狀或毛刷狀，HE染色顯示已無軟骨細胞，番紅0染色弱陽性；軟骨蛋白聚糖免疫組化染色陰性，Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性。結(jié)果證實：經(jīng)胰酶和去污劑等方法處理關(guān)節(jié)軟骨粒，不但脫去

5、了軟骨的細胞成分，而且敲除了軟骨蛋白聚糖，使之呈現(xiàn)絨球狀或毛刷狀，增大了其表面接觸面積，成功制備出以Ⅱ型膠原為主要成分、含少許GAG的關(guān)節(jié)軟骨源性微載體。然后，為了解關(guān)節(jié)軟骨源性微載體與軟骨細胞的體外相容性，我們把關(guān)節(jié)軟骨源性微載體與第6代人軟骨細胞共培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：將此微載體加入培基后，即刻見有呈圓球形的軟骨細胞與微載體相粘附，2小時見微載體上粘附了大量軟骨細胞，仍呈圓球形，8小時見微載體上粘附的大量軟骨細胞仍呈圓球形，

6、而瓶底貼附的軟骨細胞已呈現(xiàn)為成纖維細胞樣形狀，30小時見軟骨細胞-微載體復合體已沉降貼附于培養(yǎng)瓶底部，軟骨細胞增殖明顯并向周圍伸展，整個觀察期間均見軟骨細胞增殖良好，提示制備的關(guān)節(jié)軟骨源性微載體對軟骨細胞無毒害作用。結(jié)果證實關(guān)節(jié)軟骨源性微載體與軟骨細胞的體外相容性良好。 由于微載體技術(shù)需要使用特殊的儀器—生物反應器，這使其應用范圍受到一定的限制，為克服這一缺陷，我們在關(guān)節(jié)軟骨源性微載體制備的基礎(chǔ)上，摸索出關(guān)節(jié)軟骨源性海綿的制備方

7、法，并成功制備出關(guān)節(jié)軟骨源性海綿。方法簡要如下：切取關(guān)節(jié)軟骨，對之冷凍干燥后，經(jīng)粉碎機粉碎，篩取38um～25um大小的軟骨粒，經(jīng)0.25％胰酶在37℃消化24h，再經(jīng)1％TritonX-100震蕩72h，凍干12h后，經(jīng)紫外線照射8h，完成制備?？闺x散性試驗證實關(guān)節(jié)軟骨源性海綿的抗離散性良好；掃描電鏡測定其孔徑大小在100～200um；壓汞法測定其孔隙率為92％；體內(nèi)降解時間約4周；對細胞無毒；與軟骨細胞的體外相容性良好；經(jīng)關(guān)節(jié)軟骨源