以PLGA和Pluronic-F127為支架構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景及現(xiàn)狀: 關(guān)節(jié)軟骨全層損傷往往并發(fā)軟骨下骨硬化或囊性變等損傷，骨壞死后期因關(guān)節(jié)面塌陷可致關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞，因此長(zhǎng)骨干骺端病損無(wú)論原發(fā)于關(guān)節(jié)軟骨或骨，到后期均表現(xiàn)為骨軟骨同時(shí)破壞，目前對(duì)這種軟骨合并軟骨下骨損傷的治療困難，效果欠佳<'[1,2,3]>。尤其關(guān)節(jié)軟骨再生能力極其有限，一旦損傷，病損關(guān)節(jié)往往不可遏止地逐步惡化，最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎(o s t e o a r t h r i t i s，O A)。僅修復(fù)軟骨而不

2、處理病變的軟骨下骨也難以得到滿意的效果。各種原因所致的關(guān)節(jié)壞死、關(guān)節(jié)缺損、關(guān)節(jié)強(qiáng)直、關(guān)節(jié)攣縮等是導(dǎo)致患者導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，傷殘，引起關(guān)節(jié)永久性的結(jié)構(gòu)和功能損失的重要原因，這種情況在負(fù)重的髖、膝等大關(guān)節(jié)尤其常見(jiàn)。 隨著材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)以及相關(guān)物理、化學(xué)學(xué)科的發(fā)展，一種新的組織缺損的修復(fù)方法——組織工程(tissue engineering)逐漸被提出并應(yīng)用。組織工程是一門應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，來(lái)研究正?；虿±?/p>

3、狀況下哺乳動(dòng)物組織的結(jié)構(gòu)、功能和生長(zhǎng)機(jī)制，研究開(kāi)發(fā)能夠修復(fù)、維持或改善損傷組織的人工生物替代物的新興綜合性交叉學(xué)科。其最基本的思路是采集功能相關(guān)的活細(xì)胞，種植于天然或人工合成的、具有一定空間結(jié)構(gòu)的三維支架上，在體外培養(yǎng)，使細(xì)胞大量增殖，然后將其移植人體內(nèi)，達(dá)到形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織和器官的目的。細(xì)胞培養(yǎng)支架的選擇是組織工程學(xué)研究的焦點(diǎn)之一。支架材料作為人工細(xì)胞外基質(zhì)，為功能細(xì)胞的停泊、生長(zhǎng)、繁殖、新陳代謝提供三維空間。隨著材料的降

4、解吸收，細(xì)胞所分泌的基質(zhì)長(zhǎng)人，逐漸形成新的組織，在這一發(fā)育過(guò)程中，逐漸替代病變的組織或改善其功能<'[4]>。其三大要素是：種子細(xì)胞、支架材料及工程組織和器官的發(fā)生，其中支架材料具有不可替代的主要作用，且與材料科學(xué)的發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。組織工程的出現(xiàn)為解決組織缺損的問(wèn)題提供了新思路．使組織缺損的完全再生成為可能<'[4]>。 人體的器官由多種不同的組織成分構(gòu)成，關(guān)節(jié)頭由骨及其表面的透明軟骨構(gòu)成，具有特殊的解剖結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)，

5、用人工材料難以完全替代，再造生物性關(guān)節(jié)頭正是組織工程技術(shù)最有前景的領(lǐng)域之一。目前組織工程技術(shù)用來(lái)再造細(xì)胞成分單一的組織，如軟骨、骨等，己獲得廣泛的成功<'[5,6]>。但對(duì)于由多種細(xì)胞成分構(gòu)成的復(fù)雜組織的再造，研究報(bào)道還較少。 單純組織工程軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨復(fù)合缺損時(shí)，移植體與移植床的愈合的界面是軟骨～軟骨界面的整合；若合并軟骨下骨缺損，則尚有軟骨～骨界面的整合。其修復(fù)過(guò)程中上述兩種界面的整合較慢，移植體在移植床存在植入早期的不

6、穩(wěn)定等潛在的不穩(wěn)定因素，可能導(dǎo)致修復(fù)失敗因素。骨組織之間的整合比骨和軟骨間整合快而且更加牢固．本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建組織工程骨與軟骨復(fù)合物，旨在修復(fù)軟骨下骨缺損同時(shí)，使移植體在缺損區(qū)的整合固定界面由軟骨～骨變?yōu)楣恰墙缑?，從而加快界面的愈?'[7,8]>。 采用帶骨軟骨移植修復(fù)負(fù)重面軟骨缺損具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)軟骨下的骨栓與受體部位的骨床可以緊密嵌合，獲得初期的穩(wěn)定性，這為以后的生物學(xué)愈合修復(fù)過(guò)程奠定了基礎(chǔ)；(2)軟骨下骨是松質(zhì)骨，它與受

7、體骨槽的結(jié)合部位有豐富的血供，從而為移植體的存活創(chuàng)造了條件；(3)軟骨下骨與受體骨槽完成骨的一期愈合過(guò)程，沒(méi)有多少骨痂形成，松質(zhì)骨骨小梁逐漸連通，成骨細(xì)胞爬入，骨縫消失，為移植軟骨的負(fù)重功能提供良好的基礎(chǔ)；(4)透明軟骨之間的間隙可以通過(guò)軟骨細(xì)胞爬入，纖維細(xì)胞的化生等過(guò)程進(jìn)行修復(fù)，從而彌合間隙，完成最終的修復(fù)過(guò)程，獲得一個(gè)局部光滑平整、可以承重的透明軟骨面<'[9,10]>。 采用組織工程學(xué)方法構(gòu)建骨軟骨復(fù)合組織的時(shí)間并不長(zhǎng)，近

8、5年來(lái)逐步從外培養(yǎng)發(fā)展到體內(nèi)植入，研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一些新問(wèn)題。例如，李旭升<'[11]>等將骨髓基質(zhì)細(xì)胞(B M S C s)成誘導(dǎo)軟骨后接種于快速成形的三維支架材料聚乳酸/聚羥乙酸共聚物(P L G A)構(gòu)建組織工程軟骨，經(jīng)成骨誘導(dǎo)的B M S C s接種于聚乳酸/聚羥乙酸共聚物/磷酸三鈣(P L G A/T C P)構(gòu)建組織工程骨，在體外分別培養(yǎng)2周后，將兩種工程化組織及兩者以無(wú)損傷線縫合形成的組織工程骨軟復(fù)合體分別植入自體股部肌袋

9、，術(shù)后8周取材，行組織學(xué)觀察。結(jié)果術(shù)后組織學(xué)觀察表明，組織工程軟骨在體內(nèi)可形成軟骨組織，組織工程骨在體內(nèi)可形成骨組織，兩者的復(fù)合體在體內(nèi)可形成骨軟骨復(fù)合物。Gao<'[12]>等將大鼠干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞后接種于透明質(zhì)酸海綿，誘導(dǎo)成成骨細(xì)胞后接種于多孔磷酸鈣陶瓷，然后用纖維蛋白陶瓷將兩者粘結(jié)在一起，于裸鼠皮下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示構(gòu)建出了骨軟骨復(fù)合組織。 但是以上方法均存在構(gòu)建組織的骨軟骨界面結(jié)合不佳的問(wèn)題。而關(guān)節(jié)骨和軟骨的界面結(jié)合

10、強(qiáng)度不足將難以滿足關(guān)節(jié)載荷的要求。目前骨軟骨復(fù)合組織構(gòu)建研究在促進(jìn)軟骨與軟骨下骨界面形成方面還有待于進(jìn)一步完善。有文章報(bào)道<'[13]>，骨軟骨界面結(jié)合不佳是由于不同支架材料本身的物理特性(如支架的熱膨脹系數(shù)，彈性性能等)。Chang<'[14]>等將組織工程軟骨凝膠支架交聯(lián)于三維的多孔磷酸鈣表面，然后接種軟骨細(xì)胞于凝膠支架，將復(fù)合物進(jìn)行體外培養(yǎng)，4周后結(jié)果顯示構(gòu)建的組織工程軟骨長(zhǎng)入了多孔支架的內(nèi)部，二者的界面結(jié)合良好，這一實(shí)驗(yàn)證明了組

11、織工程凝膠材料可以滲透入三維多孔支架的內(nèi)部。但是Chang的實(shí)驗(yàn)只是在空白成骨支架上構(gòu)建出組織工程軟骨組織，并不是真正意義上的組織工程骨軟骨復(fù)合組織。本實(shí)驗(yàn)就是希望在構(gòu)建出組織工程骨軟骨復(fù)合組織的同時(shí)，較好地解決組織工程骨軟骨界面結(jié)合欠佳的問(wèn)題。 二、研究目的: 1．探討PIuronic-F127和PLGA作為組織工程支架聯(lián)合應(yīng)用于構(gòu)建組織工程骨軟骨組織的可行性。 2．解決組織工程骨軟骨界面結(jié)合欠佳的問(wèn)題。

12、 三、研究方法: 1．兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的培養(yǎng)：分別取兔關(guān)節(jié)軟骨及脛骨骨膜，用酶消化法原代培養(yǎng)得到軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，并分別對(duì)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組化染色和堿性磷酸酶染色鑒定。繼而大量擴(kuò)增細(xì)胞。 2．組織工程骨軟骨的構(gòu)建及裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)： ①支架的預(yù)處理：將PLGA支架材料加工成厚10mm×6mm×4mm大小，用無(wú)水乙醇及三蒸水充分浸泡清洗使支架濕化。使用前泡入培養(yǎng)液中過(guò)夜預(yù)濕，并以多聚

13、賴氨酸包被，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)支架的貼附力，將PLGA支架隨機(jī)分為兩組，分別作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組1，每組各5枚。 ②組織工程骨的體外構(gòu)建：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代成骨細(xì)胞，用培養(yǎng)液配制成密度為5×10<'7>/m l的細(xì)胞懸液，緩慢滴加到干燥后的實(shí)驗(yàn)組PLGA表面，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5﹪CO<,2>孵箱，靜止培養(yǎng)4h后再加入條件培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)2d，使細(xì)胞在材料表面完全貼附。 ③組織工程軟骨的體外構(gòu)建：以PBS配制3

14、0﹪濃度的Pluronic-F127，在4℃液態(tài)狀態(tài)下將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代軟骨細(xì)胞與其混勻，制成細(xì)胞凝膠復(fù)合物，使軟骨細(xì)胞終濃度為5×10<'7>/mL。 ④組織工程骨軟骨的體外構(gòu)建及體內(nèi)培養(yǎng)：2d后取出培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞-PLGA，在其表面涂布薄層的負(fù)載軟骨細(xì)胞的Pluronic-F127水凝膠，厚約1mm。單純空白PLGA支架和單純空白Pluronic-F127凝膠分別作為對(duì)照組1和對(duì)照組2。體重為20g左右裸鼠，共5只

15、，麻醉后無(wú)菌條件下于背部正中做長(zhǎng)約1.5cm切口，鈍性分離皮下層，各組材料植入裸鼠背部皮下組織中，每只裸鼠均植入3塊材料，切口兩側(cè)分別作為實(shí)驗(yàn)組側(cè)和對(duì)照組側(cè)，切口左側(cè)植入組織工程骨軟骨復(fù)合物，切口右側(cè)植入對(duì)照組1和對(duì)照組2。術(shù)后用絲線縫合切口，75﹪酒精消毒切口。標(biāo)記后將動(dòng)物放入無(wú)菌飼養(yǎng)包內(nèi)分籠飼養(yǎng)。 3．取材并觀察標(biāo)本：于2個(gè)月后處死動(dòng)物取材，大體標(biāo)本觀察，并常規(guī)脫鈣，脫水，石蠟包埋后切片，行HE染色．光鏡下觀察骨組織及軟骨組

16、織形成情況，Ⅱ型膠原免疫組化觀察軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)能力。 四、結(jié)果: 1．大體觀察：術(shù)后2個(gè)月實(shí)驗(yàn)組成功構(gòu)建出組織工程骨軟骨組織，在PLGA的上半部分形成的組織為白色，表面較光滑，有彈性，為軟骨組織；下半部分為暗紅色，質(zhì)地較堅(jiān)硬，為骨組織，再造出的兩種組織間有清晰的界限。骨組織與軟骨組織結(jié)合牢固。 2．組織學(xué)觀察：①組織工程骨觀察：PLGA支架中可見(jiàn)有可觀察到明顯的成骨現(xiàn)象，新形成的骨組織連接成片塊狀或條索狀。

17、②組織工程軟骨觀察：軟骨組織中細(xì)胞多，形態(tài)基本正常，分布較均勻。軟骨細(xì)胞增殖成株?duì)罨驆u狀，可見(jiàn)同源軟骨細(xì)胞簇，多位于軟骨陷窩內(nèi)，基質(zhì)較豐富。③二者結(jié)合界面觀察：二者結(jié)合界面結(jié)合良好，在部分界面區(qū)域可見(jiàn)軟骨組織與骨組織相互長(zhǎng)入。 3．軟骨組織Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果陽(yáng)性，表明構(gòu)建軟骨分泌Ⅱ型膠原為主。 五、結(jié)論: Pluronic-F127和PLGA分別作為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的組織工程支架，采用向成骨細(xì)胞-支架復(fù)合物涂