TGF-β1基因修飾兔B型滑膜細(xì)胞復(fù)合Pluronic-F127構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 體外分離培養(yǎng)兔B型滑膜細(xì)胞(type B synoviocytes)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGF—β1)的重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGF—β1質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔B型滑膜細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞復(fù)合Pluronic—F127在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體內(nèi)向軟骨組織方向分化的可行性，為基因加強(qiáng)組織工程學(xué)修復(fù)軟骨損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、 方法： 1、取3月齡健康新西蘭大白兔，雌雄不限，耳緣靜脈注射空氣處死，嚴(yán)格消毒下，迅速開(kāi)腹切取小塊肝臟組織，置入凍存管，立即投入液氮中冷凍備用；同時(shí)打開(kāi)膝關(guān)節(jié)，用眼科鑷撕取關(guān)節(jié)腔內(nèi)面的滑膜組織，將術(shù)中取到的組織迅速帶入無(wú)菌室，分別應(yīng)用酶消化法行滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增，貼壁篩選、單一膠原酶消化和多次傳代法相結(jié)合行純化培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行抗Vimentin、抗CD68免疫組化鑒定細(xì)胞。 2、取出液氮中冷凍的肝臟組織，研磨成粉末，

3、Trizol法提取總RNA，分析TGF—β1mRNA序列，設(shè)計(jì)引物，用cDNA合成試劑盒合成cDNA，并行二次PCR擴(kuò)增；將帶有pcDNA3.1(+)的菌株行擴(kuò)增、搖菌、抽質(zhì)粒，將擴(kuò)增后的TGFβ1cDNA和pcDNA3.1(+)進(jìn)行酶切，將目的片段連接載體，轉(zhuǎn)化E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定轉(zhuǎn)化菌，Amp篩選，對(duì)陽(yáng)性菌克隆提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，將陽(yáng)性菌液送測(cè)序鑒定。 3、轉(zhuǎn)染前一天，取第三代滑膜細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞

4、懸液，接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為2×105，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，按lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明行pcDNA3.1-TGFβ1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，同時(shí)取另一6孔板行pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，上述兩組分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，以軟骨細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組轉(zhuǎn)染后48小時(shí)行G418篩選陽(yáng)克隆，每?jī)商烊〔糠旨?xì)胞做細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)12天，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，取部分陽(yáng)性細(xì)胞行RT—PCR檢測(cè)TGF—β1、Ⅱ型膠原、糖氨多糖的

5、瞬時(shí)表達(dá)，對(duì)RT—PCR結(jié)果用ScnImage軟件分析處理，計(jì)算相對(duì)灰度值，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各間兩兩比較，采用方差分析，P值<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另取部分陽(yáng)性細(xì)胞做細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛固定后行TGFβ1、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色。 4、在4℃將Pluronic—F127溶解，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％液體，然后與轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行混合，同時(shí)取軟骨細(xì)胞混合Pluronic—F127、空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞

6、混合Pluronic—F127作為對(duì)照組，各組細(xì)胞濃度均為5×107/mL的復(fù)合物，迅速以0.2ml注射器行裸鼠背部皮下注射，分別在術(shù)后4、6、8周處死實(shí)驗(yàn)裸鼠，取出裸鼠背部組織進(jìn)行大體標(biāo)本觀察后，制成5μ m厚切片，切片行蘇木素—伊紅(HE)染色光鏡下觀察骨組織及軟骨組織形成情況，同時(shí)進(jìn)行抗Ⅱ型膠原、抗TGF—β1免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果： 1、兔滑膜來(lái)源的B型細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，細(xì)胞呈梭形和多角形，活性良好，細(xì)胞可傳代

7、10代而無(wú)明顯退變跡象，進(jìn)行免疫組化鑒定，抗Vimentin為陽(yáng)性、抗CD68為陰性，可與A型滑膜細(xì)胞鑒別。 2、成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGFβ1，質(zhì)粒酶切后電泳顯示有pcDNA3.1和TGFβ1片段，測(cè)序結(jié)果完全符合TGFβ1 DNA序列。 3、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后，生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)活性較陽(yáng)性對(duì)照組降低，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第3天，RT—PCR檢測(cè)到TGFβ1、Ⅱ型膠原、糖氨多糖陽(yáng)性片段，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為陰

8、性；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第4天至3周，抗TGF—β1、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性顆粒，對(duì)照組為陰性。 4、分別在4、6、8周處死實(shí)驗(yàn)裸鼠，取出各組裸鼠背部組織進(jìn)行大體標(biāo)本觀察，見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組以及軟骨細(xì)胞混合Pluronic—F127組可形成透明軟骨樣組織，抗Ⅱ型膠原、抗TGF—β1免疫組織化學(xué)檢測(cè)均為陽(yáng)性，在空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞混合Pluronic—F127組均未見(jiàn)軟骨樣組織形成，免疫組化結(jié)果為陰性。 5、統(tǒng)計(jì)分析顯示，轉(zhuǎn)染

9、后各組RT—PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后TGFβ1、Ⅱ型膠原及糖氨多糖表達(dá)高于空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 脂質(zhì)體法重組pcDNA3.1-TGF—β1基因轉(zhuǎn)染的兔B型滑膜細(xì)胞，可表達(dá)TGF—β1，細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原和糖氨多糖，表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞樣生理特征，并在3周內(nèi)未見(jiàn)明顯減退，裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞混合Pluronic—F127在8周時(shí)可形成類(lèi)軟骨樣組織；B型滑膜細(xì)胞具有向軟骨樣