基因修飾成肌細(xì)胞結(jié)合可注射溫敏凝膠支架構(gòu)建組織工程骨的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的:骨缺損修復(fù)是骨科臨床實踐中常見難題之一,新興的骨組織工程研究為解決該項難題提供了全新的思路。肌衛(wèi)星細(xì)胞(musclesatellitecells,MSCs)是骨骼肌內(nèi)最主要的干細(xì)胞成分,MSCs及其體外培養(yǎng)的子細(xì)胞---成肌細(xì)胞(myoblast)具有中胚層譜系內(nèi)的可塑性,尤其具備較強(qiáng)的成骨分化能力。此外,成肌細(xì)胞還具有來源豐富、取材容易創(chuàng)傷小及培養(yǎng)方便等優(yōu)勢,且常被用作重要的基因載體,因而成為一種極具應(yīng)用前景的骨組織工

2、程種子細(xì)胞。但成肌細(xì)胞應(yīng)用于骨組織工程尚面臨一些問題:1.對成肌細(xì)胞適宜的支架材料研究不多,尤其是對以殼聚糖溫敏凝膠為代表的可注射支架缺乏相應(yīng)研究;2.成肌細(xì)胞體外擴(kuò)增時其干性(stemness)會迅速丟失,將嚴(yán)重影響細(xì)胞的成骨分化潛能及移植效率。因此,本實驗的研究目的包括:1.制備一種新型的可注射溫敏凝膠支架---殼聚糖/β-甘油磷酸鈉/膠原(C/GP/Co),觀察它對成肌細(xì)胞增殖分化的影響,探討其作為成肌細(xì)胞運載支架的可行性;2.在

3、成肌細(xì)胞中通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染msx1基因(肌節(jié)同源盒基因-1),觀察msx1短暫表達(dá)對成肌細(xì)胞培養(yǎng)過程中“干性”保持的影響;3.通過體外成骨分化誘導(dǎo)實驗和體內(nèi)異位成骨實驗,檢驗經(jīng)msx1基因修飾后成肌細(xì)胞的成骨效能。
　　方法:1.分離培養(yǎng)成肌細(xì)胞并觀察制備的C/GP/Co凝膠支架對成肌細(xì)胞生長分化的影響:(1)采用差速貼壁結(jié)合克隆分選法從綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌中分離出成肌細(xì)胞并通過結(jié)蛋白染色、成肌分化、肌球蛋白重

4、鏈染色加以鑒定;(2)以5:1:6體積比將2.0wt％的殼聚糖溶液(C)、50wt%的β-甘油磷酸鈉(GP)及2mg/mL的I型膠原蛋白溶液(Co)配置成C/GP/Co凝膠,通過掃描電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu);(3)制備不同濃度凝膠浸提液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),以CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活力,并以此計算相對增殖率(RGR)評價支架毒性;(4)成肌細(xì)胞在二維培養(yǎng)條件下的生長情況通過細(xì)胞活力實驗進(jìn)行觀察,在三維培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)則通過激光共聚焦顯微鏡和掃描

5、電鏡進(jìn)行觀察;(5)用液態(tài)的C/GP/Co復(fù)合物包裹成肌細(xì)胞,注射移植到裸鼠背部皮下組織。通過小動物活體熒光成像系統(tǒng)觀察裸鼠體內(nèi)移植物熒光信號的變化情況。4w后處死裸鼠,通過組織學(xué)觀察了解成肌細(xì)胞在凝膠內(nèi)的存活情況;(6)評價凝膠介質(zhì)對成肌細(xì)胞向成肌、成骨、成脂方向分化能力的影響。以常規(guī)膠原包被表面培養(yǎng)的成肌細(xì)胞為對照組,C/GP/Co凝膠表面上進(jìn)行培養(yǎng)的成肌細(xì)胞為C/GP/Co組。成肌分化通過融合指數(shù)(FI)和肌管大小進(jìn)行評價;成骨分

6、化通過堿性磷酸酶(ALP)活性、茜素紅染色進(jìn)行評價,成脂分化通過油紅O染色進(jìn)行評價。2.利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將msx1轉(zhuǎn)染到成肌細(xì)胞,并評價經(jīng)基因修飾后的成肌細(xì)胞后是否能保持“干性”:(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染msx1基因到成肌細(xì)胞并采用免疫印跡實驗(WB)予以鑒定;(2)比較經(jīng)msx1基因修飾(實驗組)和未經(jīng)該基因修飾的成肌細(xì)胞(對照組)在細(xì)胞形態(tài)、衰老細(xì)胞比例、增殖能力、分化相關(guān)標(biāo)記分子表達(dá)、遷移能力等指標(biāo)上的差異。細(xì)胞形態(tài)通過透射電鏡(T

7、EM)進(jìn)行觀察,衰老細(xì)胞比例通過β-半乳糖苷酶染色實驗獲取相關(guān)數(shù)據(jù),增殖能力通過細(xì)胞增殖實驗、增殖指數(shù)(PI)、Ki67指數(shù)及集落形成率進(jìn)行評價,分化相關(guān)標(biāo)記包括myoD(成肌分化因子)、Pax-7(配對盒轉(zhuǎn)錄因子-7)和SSEA-1(階段特異性胚胎抗原-1),遷移能力通過Transwell實驗進(jìn)行評價;(3)比較同代實驗組與對照組成肌細(xì)胞在scid/mdx小鼠模型中的移植效率以及不同代次的實驗組細(xì)胞在該模型中的移植效率;3.評價經(jīng)ms

8、x1基因修飾后成肌細(xì)胞的成骨效能:(1)通過成骨誘導(dǎo)分化實驗比較實驗組與對照組成肌細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性、鈣鹽沉積面積及成骨分化相關(guān)基因表達(dá)水平;(2)將成肌細(xì)胞與C/GP/Co凝膠復(fù)合構(gòu)建可注射組織工程復(fù)合物,在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行異位成骨實驗,通過大體觀察、骨密度檢測、組織切片H&E染色以及骨鈣素免疫組織化學(xué)染色等方法比較對照組與實驗組成骨質(zhì)量。
　　結(jié)果:1.從小鼠骨骼肌內(nèi)分離出帶有GFP標(biāo)記的成肌細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代;成功地

9、制備了C/GP/Co凝膠支架并觀察了該材料的超微結(jié)構(gòu);該支架材料無毒,并且對成肌細(xì)胞具有良好的生物相容性,對成肌細(xì)胞體外擴(kuò)增期間多向分化能力的保持具有促進(jìn)作用:(1)培養(yǎng)的成肌細(xì)胞結(jié)蛋白染色陽性,成肌誘導(dǎo)條件下能形成肌管,肌球蛋白重鏈染色陽性;(2)制備的C/GP/Co復(fù)合物在37℃時約10min內(nèi)由液體形成水凝膠,掃描電鏡下該凝膠為蜂窩狀均質(zhì)多孔結(jié)構(gòu);(3)浸提液培養(yǎng)實驗中支架毒性分級為0到1級,說明該材料無毒;(4)成肌細(xì)胞在凝膠二

10、維及三維培養(yǎng)時均生長良好;(5)凝膠攜帶成肌細(xì)胞移植到裸鼠皮下4w后仍可觀察到綠色熒光,組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)支架上有大量成肌細(xì)胞存活;(6)凝膠介質(zhì)對成肌細(xì)胞的成肌、成骨及成脂分化均有增強(qiáng)作用。在成肌分化實驗中,C/GP/Co組細(xì)胞分化后的融合指數(shù)及肌管大小均顯著增加(p<0.05);在成骨分化實驗中,C/GP/Co組細(xì)胞在各檢測時相點的ALP活性均顯著增強(qiáng)(p<0.05),在分化21d時的礦化面積百分比也顯著增加(p<0.05);在成脂分化

11、實驗中,C/GP/Co組細(xì)胞內(nèi)油紅O染色陽性區(qū)域面積顯著增加(p<0.05)。2.Msx1轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后能有助于細(xì)胞保持“干性”:(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒成功轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞并使后者異位表達(dá)msx1蛋白;(2)實驗組成肌細(xì)胞較對照組成肌細(xì)胞相比:在TEM鏡下具有更小而圓的外型及更年輕化的超微結(jié)構(gòu);衰老細(xì)胞百分比顯著降低(p<0.05);具有更高的增殖指數(shù)(p<0.05)、Ki67指數(shù)(p<0.05)及集落形成率(p<0.05);在免疫熒光陽性率和平

12、均光密度值兩項評價指標(biāo)中,SSEA-1和Pax-7表達(dá)水平均上調(diào)而myoD表達(dá)水平下調(diào)(p<0.05);Transwell實驗中表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移能力(p<0.05),且該能力與SDF-1/CXCR4(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1/細(xì)胞表面趨化因子受體4)軸有關(guān);(3)移植到scid/mdx小鼠模型后實驗組細(xì)胞存活率更高,隨時間推移有更多細(xì)胞在宿主體內(nèi)增殖并分化融合并表達(dá)肌營養(yǎng)不良蛋白(p<0.05),并且這種高移植效率在細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程中能有效

13、保持。3.實驗組成肌細(xì)胞與對照組相比具有更高的成骨效能:(1)體外成骨誘導(dǎo)實驗中,各檢測時相點實驗組的ALP活性、礦化面積百分比均顯著高于對照組,成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平也顯著高于對照組(p<0.05);(2)異位成骨實驗中實驗組可注射組織工程復(fù)合物:大體觀察中形成的骨樣組織體積及硬度更大,骨密度(p<0.05)、新生骨小梁面積百分比(p<0.05)以及骨鈣素染色陽性區(qū)域面積均顯著高于對照組。
　　結(jié)論:1.C/GP/Co是一種可注