Nell-1基因修飾的組織工程化骨修復(fù)頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、修復(fù)下頜骨臨界缺損(critical-size defect,CSD)是口腔臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的難題.用組織工程方法進(jìn)行人工骨修復(fù),被認(rèn)為是未來(lái)骨缺損修復(fù)和骨再造的有效方法之一.Nel樣I型分子基因(Nel-like,type 1molecule,Nell-1)作為一種新克隆的成骨相關(guān)基因,具有安全性以及明顯的成骨作用.迄今尚無(wú)Nell-1作為成骨相關(guān)因子在組織工程修復(fù)下頜骨的報(bào)道. 本文應(yīng)用分子生物學(xué)和組織工程的方法,通過(guò)腺病毒

2、介導(dǎo)的Nell一1基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,bMSCs),研究Nell-1基因?qū)MSCs增殖及成骨分化的影響,構(gòu)建Nell-1基因轉(zhuǎn)染的bMSCs與β-磷酸三鈣(β-tricalcitim phosphate,β-TCP)支架材料復(fù)合形成的組織工程化骨,進(jìn)行裸鼠體內(nèi)及大鼠自體下頜骨CSD修復(fù)的研究. 材料與方法：1.貼壁法培養(yǎng)Fisher 344大鼠bMSCs并進(jìn)行成骨分化

3、誘導(dǎo),體外應(yīng)用腺病毒載體進(jìn)行Nell-1基因轉(zhuǎn)染并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率.反轉(zhuǎn)錄PCR和Westernblot證實(shí)基因表達(dá)2.體外轉(zhuǎn)染基因后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,Von Kossa硝酸銀法檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)形成,堿性磷酸酶(alkaline plosphatase,ALP)定量測(cè)定和放射免疫法測(cè)定骨鈣素(osteocalcin,OC)含量檢測(cè)成骨細(xì)胞表型.實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time PCR)檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá).3.轉(zhuǎn)染目的基因的bMSCs β-T

4、CP支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程化骨植入裸鼠體內(nèi),4周后進(jìn)行HE染色觀察并進(jìn)行成骨面積分析.4.創(chuàng)建直徑為5mm,全層骨膜骨質(zhì)缺損的圓形大鼠下頜骨CSD模型,Nell-1基因轉(zhuǎn)染的bMSCs復(fù)合β-TCP對(duì)缺損進(jìn)行修復(fù),術(shù)后4周、8周取材,行組織學(xué)觀察,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行成骨面積分析和Micro-CT掃描. 結(jié)果： 1.貼壁法對(duì)Fischer 344大鼠的bMSCs進(jìn)行增殖和成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng).bMSCs經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染可獲得較高的轉(zhuǎn)染效

5、率,使在正常bMSCs中不表達(dá)的Nell-1基因有轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá). 2.感染復(fù)數(shù)(Multiply of Infection,MOI)=80空斑形成單位(plagueforming unit,pfu)/cell時(shí),Nell-1基因使細(xì)胞增殖速度減緩,ALP表達(dá)增強(qiáng),鈣結(jié)節(jié)數(shù)目增加,OC表達(dá)增強(qiáng).Nell-1使ALP早期抑制,中期和晚期上調(diào),OC晚期上調(diào),骨橋蛋白(OP)和骨涎蛋白(BSP)上調(diào),Sox9下調(diào). 3.

6、bMSCs復(fù)合β-TCP材料構(gòu)建的組織工程化骨在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)良好,裸鼠體內(nèi)植入4周后,轉(zhuǎn)染:Nell-1基因的試驗(yàn)組新骨面積百分比達(dá)到34.1﹪±5.4﹪,大于未轉(zhuǎn)染bMSCs組的18.2﹪±3.0﹪和轉(zhuǎn)染LacZ基因組的18.8﹪±3.8﹪(p<0.05). 4.構(gòu)建的組織工程化骨在缺損模型內(nèi)生長(zhǎng)良好.修復(fù)后4周和8周轉(zhuǎn)染Nell-1 基因的試驗(yàn)組新骨面積百分比達(dá)到28.63﹪±5.03﹪和60.59﹪±8.26﹪,均大于未轉(zhuǎn)

7、染 bMSCs 組的 16.72﹪±0.81﹪,34.74﹪±4.40﹪和轉(zhuǎn)染 LacZ 基因組的 17.29﹪±1.44﹪,38.81﹪±3.82﹪(p<0.05). 結(jié)論： 1.腺病毒載體可有效的轉(zhuǎn)染Nell-1基因并使其獲得表達(dá). 2.MOI=80pfu/cell時(shí),Nell-1基因促進(jìn)大鼠bMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)獲得成骨分化表型并抑制細(xì)胞增殖.Nell-1基因?qū)Υ笫骲MSCs成骨相關(guān)基因的影響經(jīng)與文獻(xiàn)比較,