基于溫敏性殼聚糖水凝膠的可注射性組織工程髓核的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 驗(yàn)證自行制備的溫敏性殼聚糖水凝膠作為髓核細(xì)胞支架材料構(gòu)建組織工程髓核的可行性。 方法： 1．溫敏性殼聚糖水凝膠的制備及生物學(xué)評(píng)價(jià) 以殼聚糖、β-甘油磷酸鈉水溶液和羥乙基纖維素溶液為原料制備殼聚糖水凝膠支架，觀(guān)察其物理性狀，并進(jìn)行全身毒性、細(xì)胞毒性和組織相容性等生物學(xué)評(píng)價(jià)。 2．體外構(gòu)建可注射性組織工程髓核及相關(guān)檢測(cè) 將殼聚糖水凝膠支架與兔髓核細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程髓核。復(fù)合培養(yǎng)2 d

2、，觀(guān)察髓核細(xì)胞在支架中的存活情況；復(fù)合培養(yǎng)1周，掃描電鏡觀(guān)察髓核細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況；復(fù)合培養(yǎng)3周后，行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)，并用RT-PCR方法檢測(cè)其分泌的聚集蛋白聚糖、II型膠原mRNA表達(dá)。 3．可注射性組織工程髓核修復(fù)退變椎間盤(pán)的研究 18只新西蘭大白兔手術(shù)建立腰椎間盤(pán)退行性變模型，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、空白組和治療組。在手術(shù)建立椎間盤(pán)退行性變模型結(jié)束時(shí)，在治療組椎間隙，注射溫敏性殼聚糖水凝膠與髓核細(xì)胞復(fù)合

3、物，對(duì)照組注射殼聚糖水凝膠，空白組不予任何干預(yù)。觀(guān)察椎間盤(pán)手術(shù)前后高度變化；術(shù)后12周取材大體觀(guān)察椎間盤(pán)組織結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)II型膠原含量，分光光度法測(cè)量GAG含量，觀(guān)察椎間盤(pán)退行性變修復(fù)效果。 結(jié)果： 1．制備的溫敏性殼聚糖水凝膠室溫呈液態(tài)，37℃放置15min可發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)成為固態(tài)凝膠。生物學(xué)評(píng)價(jià)證實(shí)溫敏性殼聚糖水凝膠材料無(wú)全身毒性反應(yīng)，具有良好的細(xì)胞相容性和組織相容性，在生物體內(nèi)一定時(shí)間后可以降解。

4、2．吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色示殼聚糖水凝膠中大多數(shù)髓核細(xì)胞存活，少數(shù)死亡，細(xì)胞存活率>90％；掃描電鏡示髓核細(xì)胞分布于網(wǎng)狀支架中，細(xì)胞表面有分泌的ECM；HE、番紅O染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示髓核細(xì)胞具有分泌ECM的功能；RT-PCR檢測(cè)示髓核細(xì)胞在殼聚糖水凝膠支架中立體培養(yǎng)3周后II型膠原、聚集蛋白聚糖基因表達(dá)水平較單純培養(yǎng)高。 3．術(shù)后12周治療組測(cè)量椎間隙高度與空白組和對(duì)照組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．

5、01)。取材大體觀(guān)察，空白組椎間盤(pán)髓核與纖維環(huán)不清，中央?yún)^(qū)域的髓核為纖維組織所替代，對(duì)照組的椎間盤(pán)中度退行性變，組織結(jié)構(gòu)尚可分清。治療組的的椎間盤(pán)輕度退行性變，組織結(jié)構(gòu)清晰，周?chē)窗l(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)，殼聚糖材料完全降解。治療組II型膠原、GAG含量高于空白組和對(duì)照組(P<0．05)。 結(jié)論： 溫敏性殼聚糖水凝膠材料具有良好生物相容性與安全性，髓核細(xì)胞與其復(fù)合培養(yǎng)后可保持正常形態(tài)及分泌功能，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)溫敏性殼聚糖水凝膠復(fù)合髓核