殼聚糖-藻酸鹽復(fù)合凝膠作為髓核組織工程支架的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 腰痛是現(xiàn)代化社會(huì)中一種常見(jiàn)的癥狀，是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要原因之一，腰椎間盤(pán)突出癥等椎間盤(pán)退行性疾病(DDD)是引起腰痛最常見(jiàn)的原因。伴隨人體的老化，椎間盤(pán)也相應(yīng)發(fā)生退行性改變，外科治療方法如椎間盤(pán)切除或椎間融合術(shù)等手段是以犧牲椎間盤(pán)節(jié)段功能為代價(jià)的，而且會(huì)導(dǎo)致相鄰節(jié)段更快的退變。如何延緩和降低椎間盤(pán)退變的速率，以及研究符合椎間盤(pán)包括髓核結(jié)構(gòu)與功能的移植物，對(duì)退變椎間盤(pán)進(jìn)行功能重建，已成為椎間盤(pán)退行性疾病比較理想的解決

2、方案。 組織工程是一個(gè)新興的學(xué)科，通過(guò)將細(xì)胞與支架材料復(fù)合，加以生長(zhǎng)因子。理想的結(jié)果可以修復(fù)或替換無(wú)功能或退變的組織器官．組織工程學(xué)的迅速發(fā)展和關(guān)鍵技術(shù)的突破，促進(jìn)了髓核組織工程的發(fā)展。種子細(xì)胞和支架材料是其關(guān)鍵的問(wèn)題。干細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞有其不可替代的優(yōu)勢(shì)，胚胎干細(xì)胞由于醫(yī)學(xué)倫理上的爭(zhēng)議受到限制，而間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可從成人獲取，應(yīng)用廣泛，除了骨髓外，脂肪組織同樣可分離出干細(xì)胞。髓核細(xì)胞的起源目前還不肯定，但大多數(shù)

3、的研究者認(rèn)為其與軟骨細(xì)胞非常類(lèi)似，稱(chēng)其為軟骨樣細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞(ADSCs)具有多向分化潛能，可以誘導(dǎo)分化為軟骨樣細(xì)胞，被認(rèn)為是理想的種子細(xì)胞；髓核組織的特殊生理結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能要求髓核組織工程支架應(yīng)該同時(shí)滿足以下條件：①生物相容性良好；②降解速率適當(dāng)；③三維立體多孔結(jié)構(gòu)；④具有一定的機(jī)械強(qiáng)度；⑤良好的細(xì)胞界面；⑥加工性能優(yōu)異等。本課題選用ADSCs作為種子細(xì)胞，制備殼聚糖/藻酸鹽凝膠支架材料，研究殼聚糖/藻酸鹽凝膠材料對(duì)ADSCs增殖和

4、分化的影響；并對(duì)其作為髓核組織工程的支架材料的重要指標(biāo)如孔隙率、孔隙大小、以及細(xì)胞在該支架材料上的增殖能力進(jìn)行了探討。 目的： 1．進(jìn)一步明確兔ADSCs在體外培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性及其成軟骨能力，探索更為有效的ADSCs體外培養(yǎng)方法。 2．制備殼聚糖—藻酸鹽復(fù)合凝膠材料，檢測(cè)該三維支架材料的孔隙情況和初步探討該復(fù)合材料的細(xì)胞相容性，研究殼聚糖—藻酸鹽復(fù)合凝膠對(duì)兔ADSCs增殖和分化影響，為殼聚糖—藻酸鹽復(fù)合凝膠

5、作為髓核組織工程中ADSCs的載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．提取兔原代ADSCs，用DMEM完全培養(yǎng)基和成軟骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基(CM)體外培養(yǎng)，進(jìn)行干細(xì)胞檢測(cè)，倒置相差顯微鏡和HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)；活細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；計(jì)算細(xì)胞貼壁率，AB和VanGieson染色以判斷細(xì)胞是否向成軟骨樣細(xì)胞分化。 2．制備殼聚糖—藻酸鹽凝膠支架，掃描電鏡觀察材料結(jié)構(gòu)，計(jì)算孔隙大小，孔隙率。 3．將兔ADSCs接種于

6、殼聚糖—藻酸鹽支架上，用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(CM)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，通過(guò)掃描電鏡、阿利新藍(lán)、番紅O染色進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察；在培養(yǎng)7d、14d、21d時(shí)取標(biāo)本行組織學(xué)檢測(cè)，測(cè)定培養(yǎng)物中糖胺聚糖(GAG)含量及Ⅱ型膠原的含量量。 結(jié)果： 1．體外培養(yǎng)的兔原代ADSCs貼壁生長(zhǎng)，呈梭形和多角形，傳代后細(xì)胞分裂增殖活躍；誘導(dǎo)后的ADSCs的形狀趨向于類(lèi)圓形，使用條件培養(yǎng)基向成軟骨誘導(dǎo)后的兔ADSCs倍增時(shí)間由34.90h延長(zhǎng)至

7、43.73h，即增殖速度減慢；VanGieson染色及AB染色顯示有Ⅱ型膠原成分和蛋白聚糖成分。 2．殼聚糖—藻酸鹽支架具有網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑大小在50μm-200μm之間，并有較高的孔隙率，為80.57％。 3．倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)良好。體外培養(yǎng)7d、14d、21d時(shí)，誘導(dǎo)組培養(yǎng)液中細(xì)胞外基質(zhì)sGAG含量(ug/ml)分別為：18.69±3.56，53.92±3.22，73.97±7.31；DMEM

8、組培養(yǎng)液中細(xì)胞外基質(zhì)GAG含量(ug/ml)分別為：21.31±2.1，36.63±4.14，38.02±9.34，兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；Ⅱ型膠原含量?jī)山M間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。阿里新藍(lán)染色和番紅O染色陽(yáng)性。 結(jié)論： 1．脂肪干細(xì)胞提取方便，成軟骨誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞細(xì)胞表現(xiàn)出軟骨樣細(xì)胞的生物學(xué)特性，可以作為髓核細(xì)胞組織工程的種子細(xì)胞。 2．殼聚糖—藻酸鹽凝膠三維支架具有較理想的髓核組織