組織工程纖維環(huán)-髓核復(fù)合組織的構(gòu)建及評(píng)估.pdf

1、目的：1.評(píng)估絲素蛋白來(lái)源的一體化纖維環(huán)-髓核(AF-NP)支架作為組織工程椎間盤支架的可行性。2.探討取向性聚己內(nèi)酯(PCL)纖維環(huán)支架復(fù)合兔 AF細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程纖維環(huán)的可行性。3.探討以取向PCL/海藻酸鈉水凝膠復(fù)合兔椎間盤AF細(xì)胞和NP細(xì)胞裸鼠皮下構(gòu)建組織工程椎間盤的可行性。
　　方法：
　　1.以絲素蛋白溶液為原料，分別采用石蠟球致孔法和相分離法制備三維多孔一體化 AF-NP支架。采用體視顯微鏡、掃描電鏡(SE

2、M)觀察支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測(cè)定雙相支架AF相和NP相的孔徑、孔隙率及一體化支架壓縮彈性模量；分離培養(yǎng)兔 AF細(xì)胞和 NP細(xì)胞，接種至雙相支架的相應(yīng)部位，體外培養(yǎng)48 h，SEM、Live/dead、HE染色評(píng)價(jià)支架與細(xì)胞的生物相容性；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。2.以PCL為材料，采用濕紡-成形法制備環(huán)形取向微米纖維環(huán)支架。采用體式顯微鏡、SEM、Micro-CT觀察支架表面形態(tài)、纖維直徑，測(cè)定支架的孔隙率。分離培養(yǎng)兔AF細(xì)胞并接種至 P

3、CL支架上，體外培養(yǎng)。通過SEM、Live/dead、鬼筆環(huán)肽染色、DiI熒光標(biāo)記，觀察細(xì)胞在支架上的活性、形態(tài)、黏附、遷移情況，評(píng)價(jià)支架生物相容性。分別于體外培養(yǎng)1周、3周組織學(xué)染色觀察，并行 MTT檢測(cè)及蛋白多糖、膠原生化定量分析；RT-PCR檢測(cè)AF細(xì)胞蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ型膠原基因表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)其力學(xué)性能。
　　3.以PKH26標(biāo)記的AF細(xì)胞接種到取向PCL纖維支架，復(fù)合海藻酸鈉水凝膠包裹PKH67標(biāo)記的NP細(xì)胞，體外培養(yǎng)1周

4、后，植入裸鼠皮下構(gòu)建組織工程椎間盤；體內(nèi)培養(yǎng)8周后，動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)椎間盤細(xì)胞體內(nèi)熒光分布情況；復(fù)合物植入4周、8周后，取材、冰凍切片，觀察細(xì)胞熒光情況，行組織學(xué)染色評(píng)估；同時(shí)分析其力學(xué)性能。
　　結(jié)果：
　　1.體視顯微鏡和SEM見支架AF相和NP相均呈相互連通的多孔結(jié)構(gòu)，孔隙高度連通，交接區(qū)域結(jié)合緊密；AF相孔徑為（220.0±23.1）μm，NP相孔徑為（90.0±17.8）μm；孔隙率分別為91％和93%；一

5、體化支架壓縮彈性模量為（150.7±6.8）kPa。SEM和HE染色見細(xì)胞均勻地黏附在支架表面，細(xì)胞周圍有細(xì)胞外基質(zhì)分泌；Live/dead染色顯示細(xì)胞活性良好；CCK-8增殖分析顯示兩種細(xì)胞均具有良好的增殖活性。
　　2.體式顯微鏡、SEM、Micro-CT示PCL纖維排列呈平行取向，纖維表面光滑、規(guī)則，直徑均勻。纖維直徑(16.13±2.77)μm，孔隙率(69.33±6.67)%。SEM見細(xì)胞長(zhǎng)梭形粘附在支架上；Live/d

6、ead染色示細(xì)胞活性良好；鬼筆環(huán)肽染色示細(xì)胞肌絲沿PCL纖維取向性伸展；DiI熒光標(biāo)記示細(xì)胞遷移滲透到支架內(nèi)部；組織學(xué)染色顯示細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均沿微米纖維取向性分布，且21天染色陽(yáng)性強(qiáng)度較7天增強(qiáng)；MTT分析，蛋白多糖、Ⅰ、Ⅱ型膠原生化定量檢測(cè)顯示細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸增加（P<0.05）；RT-PCR顯示細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達(dá)逐漸增加（P<0.05）。壓縮模量和拉伸模量均隨培養(yǎng)時(shí)間增加而逐漸增加。
　　3.

7、組織工程化椎間盤大體觀察見圓盤狀類椎間盤樣組織；活體熒光成像系統(tǒng)顯示在 AF相強(qiáng)紅色熒光，NP相上弱綠色熒光，其他位置未見明顯熒光；植入4周、8周后取材切片，熒光顯微鏡下觀察見AF細(xì)胞呈紅色熒光標(biāo)記的長(zhǎng)梭形取向性生長(zhǎng)，NP細(xì)胞呈綠色熒光標(biāo)記的圓形或短梭形生長(zhǎng)，交界區(qū)域未見兩種細(xì)胞的明顯遷移混合；HE染色可見支架內(nèi)部有大量圓形或短梭形細(xì)胞；蕃紅-O染色示AF相與NP相均呈陽(yáng)性，NP相陽(yáng)性強(qiáng)度強(qiáng)于AF相；AF相Ⅰ型膠原免疫組化染色、NP相Ⅱ

8、型膠原免疫組化染色均為陽(yáng)性，且8周組染色陽(yáng)性強(qiáng)度增強(qiáng)。力學(xué)性能分析顯示細(xì)胞支架復(fù)合物壓縮模量隨植入時(shí)間增加而逐漸增加。
　　結(jié)論：
　　1.以天然絲素蛋白構(gòu)建一體化AF-NP支架，具有良好的孔徑、孔隙率和細(xì)胞相容性，具有優(yōu)越的力學(xué)性能，適合作為組織工程椎間盤支架。
　　2.濕紡-成形法制備環(huán)形取向性PCL微米纖維支架復(fù)合兔AF細(xì)胞能夠構(gòu)建在解剖結(jié)構(gòu)、生化組成及力學(xué)性能上與天然纖維環(huán)組織相似的組織。
　　3.以取向