藻酸鹽-β-磷酸三鈣復(fù)合材料作為骨組織工程支架的初步研究.pdf

1、組織工程學(xué)是20世紀80年代末期隨著細胞生物學(xué)及生物材料學(xué)技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的一門多學(xué)科交叉的邊緣學(xué)科，它綜合應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的基本理論和技術(shù)，在體外將活細胞和細胞支架(scaffold)或稱細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)通過一定的方式結(jié)合起來，制造出有功能的新組織，用以修復(fù)、維持或改善損傷組織功能的一門學(xué)科。目前臨床上常用的組織修復(fù)方法有自體組織移植、異體組織移植或應(yīng)用人工代用品，這些方法都分別存在免疫

2、排斥反應(yīng)及供體來源不足等問題。組織工程學(xué)的興起和發(fā)展為損傷修復(fù)開辟了一條新的途徑；其研究主要包括種子細胞、生物材料、構(gòu)建組織器官的方法和技術(shù)，而核心是建立由細胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體。這種細胞生物材料復(fù)合體的優(yōu)點是可形成具有生物活性的組織，對病損組織進行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達到永久性替代；用較少的組織細胞通過在體外培養(yǎng)擴增后，進行大塊組織缺損的修復(fù)；可按組織器官缺損情況塑形，實現(xiàn)比較完美的功能及形態(tài)修復(fù)。 組織工程學(xué)

3、的迅速發(fā)展和關(guān)鍵技術(shù)的突破，促進了骨組織工程的發(fā)展。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能，可以定向誘導(dǎo)分化為成骨細胞，被認為是理想的種子細胞；骨組織的特殊生理結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能要求骨組織支架應(yīng)該同時滿足以下條件：①生物相容性良好；②降解速率適當(dāng)；③三維立體多孔結(jié)構(gòu)；④具有可塑性和一定的機械強度；⑤良好的細胞界面；⑥加212'陛能優(yōu)異等。本課題選用全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)BMSCs作為種子細胞，研究藻酸鈣凝膠對BMSCs增殖和分化的

4、影響；制備藻酸鹽/β一磷酸三鈣(p-TCP)三維支架材料，并對其作為骨組織工程的支架材料的重要指標(biāo)如孔隙率、孔隙大小、孔隙間交通性以及細胞在該支架材料上的增殖能力進行了初步探討。 目的 1．進一步明確大鼠BMSCs在體外全骨髓培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性及其成骨能力，探索更為簡便有效的BMSCs體外培養(yǎng)方法。 2．研究藻酸鈣凝膠對BMSCs增殖和分化影響，為藻酸鹽作為骨組織工程中BMSCs的載體提供實驗依據(jù)。

5、3．制備新型藻酸鹽／β-TCP復(fù)合支架材料，檢測該三維支架材料的孔隙情況和初步探討該復(fù)合材料的細胞相容性，為這種新型復(fù)合細胞外基質(zhì)材料在骨組織工程中的應(yīng)用提供相關(guān)實驗依據(jù)。 方法1．提取大鼠原代BMSCs，用ctMEM完全培養(yǎng)基(SaMEM)和成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基(Dex-SaMEM)體外培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡和HE染色觀察細胞形態(tài)；臺盼藍活細胞計數(shù)繪制細胞生長曲線；ALP檢測試劑盒檢測ALP含量變化和vonKossa染色檢測細胞礦

6、化結(jié)節(jié)以判斷細胞是否向成骨分化。 2．將BMSCs種植在藻酸鈣凝膠上，通過倒置相差顯微鏡和甲苯胺藍染色觀察細胞形態(tài)；MTT法測定細胞在藻酸鹽凝膠上的增殖活性；RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因(堿性磷酸酶、I型膠原、骨連接蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白及骨鈣素)的mRNA表達。 3．采用C02成孔一冷凍干燥復(fù)合法制備藻酸鹽/β-TCP多孔復(fù)合材料，通過液體替代法測定支架孔隙率，光學(xué)顯微鏡觀察支架材料剖面的孔徑大小，掃描電鏡進一步觀察

7、三維支架材料孔徑及孔隙交通性，以了解支架的成孔情況。 4．MTT法檢測和比較生長在藻酸鹽／p-TCP三維支架和經(jīng)促進細胞粘附的I型膠原預(yù)處理的支架上的BMSCs的增殖活性。 結(jié)果 1．全骨髓培養(yǎng)法在體外培養(yǎng)的大鼠原代BMSCs貼壁生長，呈梭形和多角形，傳代后細胞分裂增殖活躍；使用條件培養(yǎng)基向成骨誘導(dǎo)后的BMSCs表現(xiàn)為與成骨細胞在體外培養(yǎng)時相似的特征，并且倍增時間由34．90h延長至43．73h，即增殖速度減慢；

8、合成ALP能力顯著增強(P<0．05)，vonKossa染色出現(xiàn)陽性的棕褐色或棕黑色團塊的鈣化結(jié)節(jié)，而未經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的對照組則無鈣化結(jié)節(jié)。 2．MTT檢測發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)板上和在藻酸鹽凝膠上用St~MEM培養(yǎng)的兩組BMSCs之間細胞的增殖活性無顯著差異(P>0．05)；與之相似，在培養(yǎng)板上和在凝膠上用Dex-SaMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)的兩組BMSCs之間的增殖活性也無顯著差異。 3．RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Dex-SaMEM誘導(dǎo)后成骨相

9、關(guān)基因堿性磷酸酶、I型膠原、骨連接蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白及骨鈣素的表達均高于未誘導(dǎo)組。對其灰度值進行t檢驗分析：①同在培養(yǎng)板上，用Dex-SaMEM與StzMEM培養(yǎng)的BMSCs之間的差異具有顯著性(P<0．01)；②同在藻酸鈣凝膠上，Dex-SaMEM與SaMEM培養(yǎng)的BMSCs之間的差異也有顯著性(P<0．05)。 4．SaMEM培養(yǎng)條件下，凝膠上BMSCs中的成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶、I型膠原、骨連接蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋

10、白及骨鈣素的表達高于培養(yǎng)板上的BMSCs(P<0．05)；而Dex-SaMEM培養(yǎng)時，凝膠組與培養(yǎng)板組間的差異無顯著性(P>0．05)。 5．觀察四組BMSCs之間的形態(tài)，未發(fā)現(xiàn)明顯差異。 6．藻酸鹽/β-TCP復(fù)合材料具有網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，孔與孔之間相互連通，孔徑大小在20grn-600gun之間，并有較高的孔隙率，為84．41％。 7．接種在復(fù)合支架材料上的BMSCs能夠正常增殖，6d細胞數(shù)達高峰，其后逐漸下降；

11、接種在I型膠原預(yù)處理的支架材料上的BMSCs6d后仍能夠繼續(xù)增殖，到10d實驗結(jié)束時細胞數(shù)仍呈增加趨勢，兩者6d時的細胞總數(shù)有顯著差異(P<0．01)。 結(jié)論 1．全骨髓培養(yǎng)法取材方便，經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出成骨細胞的形態(tài)特征和生物學(xué)特性。因此，該方法可作為骨組織工程種子細胞培養(yǎng)的常規(guī)方法。 2．BMSCs在藻酸鈣凝膠中能夠正常增殖，并且經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后向成骨細胞分化。 3．藻酸鹽/β一TCP復(fù)合三維