殼聚糖構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 1、探討以殼聚糖為主要材料構(gòu)成的組織工程角膜支架的生物相容性。 2、培養(yǎng)保持正常表型的三種角膜細(xì)胞。 3、試用殼聚糖支架材料構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)方法。 (一)以殼聚糖為主要材料構(gòu)建的組織工程角膜支架的生物相容性比較及篩選 1、殼聚糖為主要材料的組織工程角膜支架的構(gòu)建： (1)將殼聚糖、膠原蛋白、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸鈉等溶液按照90:6:2:2的比例混合，以原花青素和戊二醛溶液作為交聯(lián)

2、劑分為兩組，分別制成不帶孔和帶孔的兩種支架。 (2)分別測(cè)量帶孔支架的含水率和膨脹率；對(duì)四種殼聚糖支架做石蠟切片染色觀察合成的支架的孔徑等形態(tài)。 2、殼聚糖支架材料生物相容性比較及篩選實(shí)驗(yàn)：40只新西蘭大白兔分為A、B、C、D、E5組，每組8只，取右眼為手術(shù)眼。A、B兩組分別為原花青素和戊二醛交聯(lián)的帶孔支架材料組，C、D兩組分別為原花青素和戊二醛交聯(lián)的不帶孔支架材料組，E組為空白對(duì)照組。每組制作直徑6mm的囊袋，分別植入

3、四種支架材料，每日觀察記錄角膜水腫、浸潤(rùn)及新生血管情況，在1周、4周、6周、2月、4月、6月、9月、10月、11月等進(jìn)行裂隙燈顯微鏡觀察照相，并取材行組織病理學(xué)檢查。比較不同的支架材料對(duì)角膜的影響。 (二)培養(yǎng)保持正常表型的三種角膜細(xì)胞 1、角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)：取新西蘭大白兔角膜緣組織置于培養(yǎng)板和羊膜上，加入DMEM/F12。 2、角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：角膜基質(zhì)組織剪成1mm左右組織塊，分別置于培養(yǎng)板和羊膜上，加入DM

4、EM/F12。將培養(yǎng)板中培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞分A、B兩組，待培養(yǎng)板中的細(xì)胞80％融合后傳代，A組改用含添加劑的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基；B組和羊膜上培養(yǎng)組繼續(xù)用DMEM/F12(內(nèi)含10％胎牛血清)培養(yǎng)。 3、角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：將含有內(nèi)皮細(xì)胞的后彈力層內(nèi)皮面朝下置于培養(yǎng)板中，加入DMEM/F12。 4、培養(yǎng)的三種角膜細(xì)胞的觀察及生物學(xué)性質(zhì)(1)形態(tài)觀察：倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)。 5、免疫組化檢測(cè)：檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞

5、特異性角蛋白K3、K12(AE5)，角膜基質(zhì)細(xì)胞的中間絲蛋白(Vim)，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的神經(jīng)纖維絲蛋白(NF)。 6、分子生物學(xué)檢測(cè)：RT-PCR檢測(cè)在羊膜和培養(yǎng)板上A、B兩組培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞特異性keratocan蛋白的表達(dá)。 (三)培養(yǎng)的三種角膜細(xì)胞分別與篩選出的原花青素交聯(lián)的殼聚糖支架共培養(yǎng)構(gòu)建角膜基質(zhì) 1、三種角膜細(xì)胞與殼聚糖支架共培養(yǎng)支架與三種角膜細(xì)胞分別共培養(yǎng)，HE染色作組織病理檢測(cè)。 2、帶

6、有上皮細(xì)胞的支架做兔角膜板層移植16只新西蘭大白兔平均分為兩組，每組取右眼為手術(shù)眼，5mm環(huán)鉆鉆取約1/3角膜厚度的板層組織，分別移植帶上皮細(xì)胞的原花青素交聯(lián)的兩種支架，每日觀察。 結(jié)果 (一)殼聚糖為主要材料按比例合成的組織工程角膜支架的生物相容性及篩選 1、殼聚糖為主要材料的組織工程角膜支架的構(gòu)建： ①大體形態(tài)：原花青素交聯(lián)的不帶孔的支架呈棕色，具有一定的透明度，戊二醛交聯(lián)的支架呈透明的薄膜；原花青素

7、交聯(lián)的帶孔的支架呈棕色，不透明，有空隙，戊二醛交聯(lián)的支架，呈白色，不透明，海綿狀。 ②.帶孔的組織工程角膜支架的特點(diǎn)：含水率：77.8％；膨脹率：76.0％ ③.HE染色：(1)帶孔的支架：支架材料紅染，具有不規(guī)則的孔徑，連成網(wǎng)狀，原花青素交聯(lián)的支架孔徑比戊二醛交聯(lián)的規(guī)則，多呈四角形，戊二醛交聯(lián)的支架呈多角形，連成網(wǎng)狀。 (2)不帶孔的支架：?jiǎn)螌蛹t染無(wú)孔隙的膜。 2、殼聚糖為主的支架材料生物相容性實(shí)驗(yàn)及篩選：

8、 (1)裂隙燈顯微鏡觀察記錄眼部一般情況： 術(shù)后A、B兩組較C、D兩組炎癥反應(yīng)重，角膜水腫明顯；E組炎癥反應(yīng)最輕，基本保持透明。 ①帶孔的支架A、B組：術(shù)后1周實(shí)驗(yàn)組共有3只眼植片脫落，其中A組1只眼，B組2只眼。A、B兩組術(shù)后1周都有結(jié)膜睫狀充血、角膜水腫情況。2周后充血水腫逐漸消失，B組消失最晚。術(shù)后3周A組5只眼長(zhǎng)入角膜新生血管，B組有6只眼；術(shù)后6周都有新生血管長(zhǎng)入，B組較A組多，A組支架材料的棕色變淺，B組

9、呈白色；術(shù)后4個(gè)月仍有較多新生血管，術(shù)后6月A、B兩組新生血管開(kāi)始變??；9月時(shí)材料大部分降解，10月A、B兩組的植入材料仍未完全吸收，角膜中少量新生血管長(zhǎng)入，11月時(shí)新生血管基本消失。12月后兩組角膜透明，僅見(jiàn)輕微瘢痕。 ②不帶孔的支架C、D兩組：術(shù)后僅有C組1只眼支架發(fā)生脫落，兩組角膜水腫和浸潤(rùn)情況無(wú)明顯差別，1月時(shí)均有新生血管長(zhǎng)入，術(shù)后2月新生血管開(kāi)始變小，4個(gè)月內(nèi)兩組的植入材料均透明，材料已大部降解；5月后角膜透明，僅見(jiàn)輕

10、微瘢痕；6個(gè)月時(shí)完全透明，未見(jiàn)明顯瘢痕。③對(duì)照組E組：僅術(shù)后2天角膜輕度水腫，以后水腫消退，角膜透明，無(wú)感染，無(wú)新生血管生長(zhǎng)。 (2)組織病理與免疫組化： ①帶孔支架的A、B兩實(shí)驗(yàn)組取不同時(shí)間的標(biāo)本HE染色：2周時(shí)兩組支架材料中有大量的炎癥細(xì)胞，B組炎癥細(xì)胞較A組多，兩組均有少量的基質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)入，E組角膜標(biāo)本與正常角膜無(wú)區(qū)別。3月后A、B兩組植入支架材料區(qū)域上皮細(xì)胞增厚，表層上皮完整，材料周邊有新生膠原和角膜基質(zhì)細(xì)胞。材料

11、部分降解，并可見(jiàn)材料碎片。10月時(shí)材料基本吸收，已被新生膠原和角膜基質(zhì)細(xì)胞取代，免疫組化結(jié)果顯示基質(zhì)細(xì)胞的非特異性抗體Vim染色陽(yáng)性。12月基本與正常角膜相同。②不帶孔支架的C、D兩組取不同時(shí)間的標(biāo)本HE染色：2周時(shí)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞反應(yīng)，4月時(shí)材料已經(jīng)大部分吸收，角膜中遺留空隙；5月時(shí)空隙基本消失。 (二)培養(yǎng)的保持正常表型的三種角膜細(xì)胞 1、上皮細(xì)胞培養(yǎng)：上皮細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，大部分保持正常細(xì)胞形態(tài)，AE5染色呈陽(yáng)性。

12、 2、基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：在羊膜和培養(yǎng)板上原代培養(yǎng)的細(xì)胞及無(wú)血清培養(yǎng)基條件下的傳代細(xì)胞均保持正常的角膜基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，分子生物學(xué)檢測(cè)keratocan蛋白陽(yáng)性表達(dá)；Vim染色呈陽(yáng)性。 3、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)板上生長(zhǎng)良好，NF染色陽(yáng)性。 (三)培養(yǎng)的三種角膜細(xì)胞分別與所篩選出的原花青素交聯(lián)的殼聚糖支架共培養(yǎng)構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì) 1、三種角膜細(xì)胞與殼聚糖支架共培養(yǎng)： 角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞可以在支架上生長(zhǎng)

13、，HE染色顯示細(xì)胞均在支架表面生長(zhǎng)，支架內(nèi)部幾乎沒(méi)有細(xì)胞長(zhǎng)入。內(nèi)皮細(xì)胞較難在支架表面上生長(zhǎng)。 2、帶有上皮細(xì)胞的支架板層移植殼聚糖支架周邊逐漸變白，角膜輕度水腫，1周時(shí)不帶孔支架全部脫落，2周時(shí)帶孔支架全部脫落。 結(jié)論： 1、原花青素交聯(lián)殼聚糖、膠原蛋白等組成的支架材料對(duì)角膜組織的刺激性小，與角膜組織具有良好的生物相容性，原花青素可能比戊二醛更適合作為組織工程角膜支架材料的交聯(lián)劑。 2、可以通過(guò)合適的培養(yǎng)