復合富血小板血漿可注射型組織工程骨的構(gòu)建與實驗研究.pdf

1、目的： 1．探討殼聚糖-β-磷酸三鈣生物材料作為可注射組織工程骨支架料的可行性、生物相容性，以及富血小板血漿(platelet-rich plasma， PRP)作為可注射組織工程材料生長因子的可行性。 2．研究PRP對MSCs成骨分化的直接作用以及經(jīng)PRP誘導后的MSCs其增殖活性、成骨分化特性，探討PRP的成骨修復作用機制。 3．制各適合可注射骨應用的中國青山羊脛骨洞型缺損模型。 4．研究新型可注射型

2、組織工程骨殼聚糖-β-磷酸三鈣(β-TCP)/PRP/骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)對青山羊脛骨洞型骨缺損的修復能力。 方法： 1．將中國青山羊MSCs體外培養(yǎng)并經(jīng)地塞米松誘導，取第三代MSCs用于試驗。將固化后的殼聚糖-β-磷酸三鈣與MSCs體外復合培養(yǎng)，分為空白對照組和材料組，MTT法進行細胞增殖檢測，倒置相差顯微鏡進行細胞行態(tài)學觀察，評價可注射材料

3、的細胞相容性；將液相的殼聚糖-β-磷酸三鈣與MSCs混合，待固化成形后切成小塊，體外培養(yǎng)后，掃描電鏡觀察細胞生長情況，評價殼聚糖-β-磷酸三鈣作為可注射組織工程骨支架料的可行性。另將體外培養(yǎng)的第3代MSCs用于實驗，將PRP與可注射材料混合，分為空白對照組、單純材料組、材料/PRP組，MTT法進行細胞增殖檢測，倒置相差顯微鏡進行細胞形態(tài)學觀察，評價PRP作為可注射材料的生長因子的可行性。 2．采用人和青山羊的MSCs，分為單純血

4、清培養(yǎng)組、DEX誘導組、PRP誘導組，通過堿性磷酸酶染色、鈣沉積染色評價PRP對堿性磷酸酶、鈣沉積的影響，采用人骨髓間充質(zhì)干細胞(humarl bone marrow mesellchymal stem cells HMSCs)，通過半定量RT-PCR檢測的PRP對HMSCs的堿性磷酸酶(A1kaline phosphatase，ALP)、骨連接蛋白(osteoIleetin，0N)、骨鈣素(Osteocalcin， OC)、Ⅰ型膠原(

5、Collagen type Ⅰ，Col1-Ⅰ)、中心結(jié)合因子(core binding factor alpha 1 Cbfal)、 TGF-β1 (transformi ng growth factor betal TGF-β1)基因的表達影響，評價PRP對MSCs的成骨分化的誘導作用。 3．將PRP誘導后的HMSCs和未誘導的HMSCs分為兩組，通過MTT法進行細胞增殖檢測，倒置相差顯微鏡進行細胞形態(tài)學觀察，評價PRP誘導后

6、的HMSCs增殖活性；以未誘導的HMSCs單純血清培養(yǎng)為對照組，PRP誘導后的HMSCs單純血清培養(yǎng)為PRP組，PRP誘導后的HMSCs進行DEX誘導為DEX組，通過堿性磷酸酶染色、鈣沉積染色、半定量RT-PCR檢測HMSCs的ALP、OC、ON、Coll-Ⅰ、 Cbfal、TGF-β1基因的表達來評價PRP誘導過的HMSCs成骨分化的能力。 4．于中國青山羊雙側(cè)脛骨內(nèi)側(cè)平臺下制作直徑1.2cm的圓洞型骨缺損，術(shù)后4、8w，通過

7、X片觀察、硬組織切片形組織學觀察，圖像分析評價可注射骨用中國青山羊脛骨洞型缺損動物模型的可靠性。 5．采用中國青山羊雙側(cè)脛骨平臺下圓洞型骨缺損模型。30只中國青山羊隨機分為5組：空白組：骨缺損部不植入任何組織工程材料；單純材料組：單純植入組織工程材料殼聚糖B一磷酸三鈣；PRP組：植入單純復合PRP的組織工程材料；MSCs組：植入單純復合MSCs的組織工程材料；PRP/MSCs組：植入復合PRP、MSCs的組織工程材料。于術(shù)后第4

8、、8W取出骨缺損區(qū)標本進行大體觀察和組織學切片觀察，圖像分析骨缺損區(qū)域新生骨組織的生成比例，評價可注射工程骨的體內(nèi)骨修復能力。 結(jié)果： 1.倒置相差顯微鏡下殼聚糖-β-TCP材料組細胞生長良好，與空白對照組無明顯差異，細胞形態(tài)正常。隨培養(yǎng)時間的延長，各組D570值逐漸增加，到第8d達最高。 2.倒置相差顯微鏡觀察殼聚糖-β-TCP/PRP組材料周邊細胞生長較快，6d～7d時匯合成單層；材料組細胞生長與對照組相似，

9、8d～10d細胞匯合成單層，所有組細胞形態(tài)正常。 3.培養(yǎng)后第7d，同F(xiàn)CS組相比，PRP同時明顯減少了HMSCs和羊MSCs ALP陽性細胞數(shù)，然而DEX明顯增加了ALP陽性細胞數(shù)。 4.第2、4、6、8d的D570值，F(xiàn)CS組分別為0.149±0.039、0.405±0.063、0.933+0.048、1.161+0.057，經(jīng)PRP誘導后的MSCs(PRP 組)分別為0.152±0.028、0.397±0.035、

10、0.964±0.033、1.03±0.061，PRP組(均數(shù)為0.654)與對照組之間(均數(shù)為0.662)比較無顯著性差異(F=0.311，P=0.580)。 5.x片顯示術(shù)后4w實驗組動物骨缺損處均未見有明顯密度增高區(qū)，術(shù)后8w骨缺損邊緣有少量密度增高區(qū)，缺損中間無骨密度增高；實驗組4w取材時大體標本顯示骨缺損周邊無明顯骨組織形成，缺損部由纖維組織填充；術(shù)后8w骨缺損邊緣有少量新骨形成，但無骨痂生長，骨缺損部仍為纖維組織填充。

11、 6.大體觀察顯示4w時各組表面有一層菲薄的纖維組織包裹，空白組骨缺損部硬度低于單純材料組，PRP組、MSCs組硬度略高于單純材料組，而PRP/MSCs組硬度最高，除空白組外，其余三組均可見骨缺損部未降解的材料。 結(jié)論： 1.MSCs/殼聚糖-β-TCP復合物表面細胞增殖良好，該生物材料具有良好的細胞相容性，可作為可注射型骨組織支架材料。復合材料中的PRP能促進體外培養(yǎng)的MSCs增殖，PRP作為可注射性材料殼聚糖

12、-β-TCP中的生長因子是可行的。 2．PRP對MSCs的直接效應是抑制成骨分化；PRP誘導后的HMSCs能恢復到正常的增殖速率，在體內(nèi)應用是安全的；PRP誘導后的HMSCs具有與正常HMSCs相同的成骨分化能力，在體外仍可經(jīng)DEX誘導向成骨細胞分化，PRP誘導后的HMSCs仍能維持較強的成骨分化活性；在PRP的直接作用下，HMSCs的TGF-β1基因表達增高，而且在PRP作用后的HMSCs仍能維持較高的TGF-β1分泌，這可能