補(bǔ)腎活血法促進(jìn)TGF-β2基因修飾的ADSCs向軟骨細(xì)胞分化的作用和機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究脂肪源性成體干細(xì)胞(ADSCs)體外增殖特性、表型特征及多向分化能力，探索補(bǔ)腎活血中藥干預(yù)對(duì)組織工程軟骨構(gòu)建的作用及其機(jī)制。
　　方法:取SD大鼠雙側(cè)腹股溝部的脂肪墊，分離培養(yǎng)ADSCs，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)原代ADSCs和篩選標(biāo)志物表達(dá)。在二維培養(yǎng)的方式下將大鼠ADSCs進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨、成神經(jīng)元誘導(dǎo)，觀察其成脂、成骨、成軟骨、成神經(jīng)元能力并予以鑒定。構(gòu)建攜帶hTGF beta2基因的5型復(fù)制缺陷型病毒，基因增強(qiáng)合并

2、補(bǔ)腎活血中藥含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的ADSCs向軟骨細(xì)胞分化:分為四組:空白對(duì)照足組、單純中藥組、基因轉(zhuǎn)染組和中藥+基因轉(zhuǎn)染組。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、行HE、甲苯胺藍(lán)染色、PCR、WB及Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化染色鑒定軟骨細(xì)胞表型。
　　結(jié)果:從SD大鼠脂肪組織可以獲得純度較高的ADSCs，而且具有良好的增殖能力，能夠進(jìn)行傳代培養(yǎng)并能保持其特性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD45、CD106呈陰性表達(dá)，CD29、CD44、CD90呈陽(yáng)性表達(dá)。在

3、二維培養(yǎng)環(huán)境中，大鼠ADSCs經(jīng)過(guò)成脂、成骨、成軟骨、成神經(jīng)元誘導(dǎo)和組織學(xué)、免疫組化鑒定，均成功獲得目的細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)中基因轉(zhuǎn)染組和中藥+基因轉(zhuǎn)染組的ADSCs在誘導(dǎo)14天后細(xì)胞爬片經(jīng)甲苯胺蘭染色和Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性，經(jīng)aggrecan細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)見(jiàn)細(xì)胞的胞漿、胞膜均有綠色熒光表達(dá)，而空白對(duì)照組和單純中藥組則僅維持貼壁生長(zhǎng)，其標(biāo)本在14天后經(jīng)甲苯胺蘭染色、Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色和aggrecan細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

4、，其結(jié)果均為陰性;同時(shí)RT-PCR和Westem-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2周時(shí)中藥+基因轉(zhuǎn)染組較基因轉(zhuǎn)染組標(biāo)本中Col2al、hTGFbeta-2和aggrecan的mRNA和蛋白的表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)，空白對(duì)照組和單純中藥組中無(wú)表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.自SD大鼠腹股溝取材可以獲得純度較高的ADSCs，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)ADSCs的純度可以得到進(jìn)一步的提高，ADSCs表達(dá)特異的表面分子，具有極強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能。